阿尔茨海默病与内质网Ca2+紊乱的研究进展

郑鹏豆,王昭君(山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室,太原 03000;山西医科大学生理学系,细胞生理学教育部重点实验室;通讯作者,E-mail:wzhaojun05@6.com)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以学习记忆能力障碍为主要表现的渐进性神经系统退行性疾病,主要累及患者的海马体和大脑皮质区。AD的主要病理特点是该病患者脑内普遍的神经元凋亡、大脑皮质内出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和老年斑(senile plaque,SP)。据报道,世界上每3 s就会出现一个该病患者[1],然而令人惋惜的是至今尚无有效缓解和完全治愈的药物问世。其发病机制复杂,目前为大多数学者所认可的假说主要有:遗传学因素、Aβ学说、兴奋性氨基酸毒性作用、钙离子(Ca2+)稳态失调、胰岛素相关代谢异常、中枢胆碱能系统受损、微管相关蛋白异常学说、自由基与氧化应激、炎症与免疫机制等,其中Ca2+失调假说受到广泛关注,该假说提出在AD发病早期Ca2+失调使得细胞信号通道异常进而造成细胞功能瘫痪,导致突触传递功能障碍和神经元受损。本文将对这一假说延伸的新型预防或治疗性药物的机制及其临床指导价值做一综述。

1 Ca2+与AD的相关性

AD的钙失调假说于1987年由生理学家Khachaturian[2]教授首次提出,但起初并未获得关注。然而近几年的科学研究提供了更加充分的证据证明神经细胞内Ca2+紊乱出现在AD病程进展中甚至是AD病理改变早期,在2017年该假说才被正式提出并简单概述了现阶段需要解释清楚的诸多疑问[3]。AD的Ca2+假说并不独立存在,与其他假说关系密切,钙信号传导通路的异常改变可能继发于β-淀粉样蛋白(Aβ)的毒性破坏、早老素(presenilin,PS)神经毒性作用和细胞器功能紊乱等。Ca2+是神经细胞内许多信号传递通路的媒介,这些离子通路包括了钙库操控的Ca2+通道(store-operated calcium entry,SOCE)、电压门控Ca2+通道(voltage-gated Ca2+channel,VGCC)和非特异性离子型谷氨酸受体(non-specific ionotropic glutamate receptor,iGluR)。神经细胞内也存在含大量Ca2+的钙储池:内质网(endoplasmic reticulum,ER)和线粒体。因此,Ca2+也能够通过ER膜上的IP3受体和Ryanodine受体释放到胞质内[4,5]。而线粒体则通过单向转运体对Ca2+进行摄取[6]。过量的Ca2+进入线粒体内造成钙超载可导致线粒体通透性转换孔(permeability transition pore,PTP)的开放,诱导细胞程序性死亡从而影响线粒体功能,继发神经功能瘫痪[7]。

散发型AD(sporadic AD,SAD)患者一般在70-80岁阶段出现首发症状,而家族型AD(familial AD,FAD)则较早出现。此时人类大脑的保护机制发挥重要的修复作用来对抗疾病的发生。当神经损伤超过修复阈值,病理改变开始出现,Ca2+失调便是其中之一。在AD的实验模型研究中发现随着疾病发展细胞外Ca2+水平不断上升,胞内Ca2+浓度也随之持续增加[2,8]。那么为什么AD发展中Ca2+浓度会进行性升高?是否存在某些信号通道异常调控?我们是否可以从其中得到预防治疗AD的新策略?此外,APP(amyloid precursor protein)、PS1(presenilin 1)、PS2(presenilin 2)这些FAD主要的潜在危险基因突变和Ca2+水平的变化最为密切。自Aβ学说创立以来,APP蛋白水解后产生的Aβ一直被认为是AD病理改变的始发因素。现在大量的研究使得其核心地位受到质疑[9,10],并提出胞内Ca2+的紊乱似乎在AD的早期病理过程中起到了至关重要的作用。PS是γ分泌酶的催化亚基,在γ分泌酶的催化下,APP水解产生有毒性的β淀粉酶。另外PS1可以作为被动Ca2+漏通道[11,12]。

2 AD中神经组织Ca2+信号变化

2.1 细胞外Ca2+信号

Aβ学说自问世以来一直被认为是导致AD的关键因素,其神经毒性作用备受学者们关注[13],但随着科学研究的发展,该学说的地位受到动摇[9,10]。现有诸多研究表明Aβ的浓集会导致细胞内Ca2+水平增加[14-21]。Lopez等[22]也发现在AD动物模型以及AD患者脑细胞内Ca2+水平均较正常参数高,并且可能是导致AD疾病进展的主要原因。有证据显示,Aβ能够促使胞内形成Ca2+通道[23],尤其是NMDAR(N-methyl-D-aspartate receptors)[24-26]。LTP(long-term potentiation)的形成需要激活的NMDAR,而LTP又是脑内形成记忆的分子基础。Aβ使NMDAR过度兴奋继发胞内钙超载,增加了神经组织的兴奋性毒素易感性[27,28]。也有研究证明Aβ寡聚体能直接结合NMDAR并对其活性进行调控[29-31]。许多研究也证明在AD早期阶段Aβ可通过激活NMDAR导致神经细胞内Ca2+水平逐步升高[26,32,33]。在神经胶质细胞特别是星形胶质细胞中也可观察到Aβ寡聚体损伤RyR介导的Ca2+信号[35]。此外亚致死浓度的Aβ寡聚体可通过影响NMDAR使Ca2+持续内流,使线粒体裂解并且抑制RyR介导的树突棘的重塑[34]。Aβ42寡聚体能够通过促使RyR介导的Ca2+释放和抑制Ca2+经NMDAR以及VGCC的内流使胞外Ca2+浓度升高,而胞内大量的Ca2+是由BK(big conductance Ca2+-activated potassium)通道激活所触发的钾离子电流造成的,同时海马的功能活动也会被抑制[36]。在体动物实验中也发现Aβ寡聚体能够激活NMDAR从而致使动物脑内基础Ca2+水平升高,致使突触棘受损[37]。相反,应用Aducanumab(抗Aβ抗体)能够通过保护NMDAR的功能有效减轻Tg2576小鼠中出现的Ca2+稳态破坏[38]。另外还有研究表明Aβ能够减少细胞膜上NMDAR的表达并增强其内吞作用[39],通过损伤NMDAR依赖的LTP[40]和减少树突棘中NMDAR抑制Ca2+内流[40,41]。

VGCC是胞膜上的另外一个钙通道。有研究指出Aβ寡聚体能破坏海马神经元的突触传递功能,而这可能是因为Ca2+通过P/Q型电压门控钙通道减少[42]。然而,也有学者表示在HEK293细胞中发现Aβ寡聚体可以增加P/Q型VGCC引发的电流[43]。这种差异的表现可能是由于同一分子在不同环境下对相同的离子通道调节作用不同所致。例如,钾通道阻断剂K-conotoxin PVIIA能通过激活钾离子通道使钾电流增强或减少[44]。还有研究表明在3xTg-AD小鼠CA1脑区中的年龄依赖的L型电压门控钙通道(L-VGCC)电流增加[45]。此外还有其他许多应用患者或者AD动物模型的研究也证实通过抑制L-VGCC的功能能有效保护神经元以及突触[45-49]。

2.2 内质网Ca2+信号

不仅神经元膜上的Ca2+通道可受到影响,ER膜上镶嵌的两个介导Ca2+释放的Ca2+通道,IP3R和RyR,也可受到Aβ的影响[50,51]。内质网不仅是蛋白质合成和空间结构形成的重要场所,同时也能够通过整合细胞内外的各种有关信号影响应激细胞的转归。另外,内质网内的Ca2+浓度可调节范围大,可通过释放、内流和重吸收等共同作用调控人体组织内各种细胞信号,使其发生一系列功能变化例如内分泌调节、肌肉收缩、细胞死亡以及学习和记忆等。有研究发现,皮层神经元内的Aβ40和Aβ25-35均能引起IP3R和RyR介导的Ca2+释放增加;此外,在成神经细胞瘤细胞中也发现Aβ42能通过IP3R介导的信号传导通路引起Ca2+释放[51]。相反,在Tg2576小鼠中可发现如果减少RyR介导的Ca2+释放会使胞内外的Aβ沉积减少[52]。Briggs等[53]学者证明胞内的Aβ和Ca2+水平的变化是相互影响的,而胞外Aβ水平和胞内Ca2+的关系仍需进一步探究。Aβ水平的增高可导致IP3通道增加可能是由于过度激活了突触mGluR5受体[54],NMDAR功能改变可能是使RyR介导的钙释放增加的原因[34,55,56]。

San Martin等[57,58]学者的研究也显示Aβ寡聚体能通过促进RyR2介导的钙释放使线粒体内Ca2+和ROS的增加甚至导致线粒体破碎。而敲除细胞膜上的RyR2能有效削弱Aβ的毒性作用同时也可保护线粒体的功能。胞内ER钙信号改变和Aβ聚集之间的关联在AD动物模型中也得到了证实[59]。给予爪蟾卵母细胞Aβ寡聚体能激活G蛋白形成IP3,继而增加Ca2+从ER释放。相反,有研究发现DT40鸡B淋巴细胞系细胞膜上的IP3R并不参与Aβ42造成的ER Ca2+释放,这或许说明Aβ42作用于ER的路径并不单一[51]。此外,ER中SERCA泵可使Ca2+内流浓聚来影响胞内Ca2+浓度[60],同时,它还是影响SOCE的主要因素之一[61]。

ER不仅可以直接调控胞内Ca2+含量,还能影响细胞膜上的钙通道和细胞器如线粒体内Ca2+的浓度[62]。ER中的Ca2+亏空可导致STIM蛋白激活,使激活的STIM蛋白从ER内转移到细胞膜上并结合细胞膜上的SOCs(store-operated Ca2+channels),例如ORAI蛋白,从而导致Ca2+重吸收的增加[63,64]。线粒体与ER之间存在具有脂质结构的单向转运体:MAM(mitochondria-associated ER membrane)[65],它通过维持ER中Ca2+向线粒体单向转运的功能,调节细胞的应激能力和线粒体的功能,可在维持胞内钙稳态的过程中起到决定性作用[66]。

3 内质网内Ca2+紊乱与AD

Aβ是AD神经组织中淀粉样斑块的主要组分,其经γ分泌酶剪切而成。γ分泌酶的催化中心是PS,因此FAD相关的变异会影响γ分泌酶的功能[67]。但是FAD突变对于γ分泌酶的功能影响的具体机制是什么还存在争议[68-70]。但调节γ分泌酶的活性能够影响Notch的产生,或许可以为治疗AD提供新的思路[71]。APP的胞内结构域也可通过调节胞内基因表达从而影响ER内Ca2+释放[72]。

诸多研究均表明AD中PS突变可导致Ca2+调节功能的紊乱,但是这种改变与Aβ的聚集和γ分泌酶功能的改变之间的关系并不密切,而是由IP3R以及RyR活性的变化导致的[53,73-75]。许多AD模型的研究都发现各种不同PS突变可使RyR表达升高从而使其介导的Ca2+释放增加[55,76-80]。PS的胞内N端区域能够与RyR相互作用从而调控Ca2+释放通道的功能[81,82]。有研究显示,正常老年鼠的前额皮层及小脑中PS2、PS1的比例显著增加,并且此类鼠有严重的空间学习记忆能力障碍和自主运动功能损伤[83],这些功能的改变都与胞内Ca2+水平的增加有关,且有年龄依赖的特点[53]。综上所述这些研究都证明了AD中胞内Ca2+浓度的过度增加以及ER过度释放Ca2+都是由PS与RyR相互作用所导致的[82]。

另外,大量的研究指出PS突变同样会使IP3R介导的Ca2+释放增加,这个现象在许多AD动物模型和细胞系中都得到了证实[78,84-86]。在PS1敲除的小鼠中也可发现IP3R介导的Ca2+信号的改变[87]。我们也发现FAD突变、PS1和PS2增强IP3R通道释放Ca2+的能力比单纯改变IP3R水平引起的改变更强,而这可能是PS影响ER Ca2+信号的间接机制。除此之外,PS也能与IP3R发生相互作用而促使其开放[86]。最近应用大数据计算模型的一项研究表明在PS突变的FAD中,只需要少量的IP3和Ca2+就能明显增强IP3R的功能活动[88]。之后,该研究小组通过计算机模拟AD模型发现PS突变会使更多的Ca2+通过IP3R释放进入胞内,同时ER通过MCU进入线粒体中的Ca2+也会更多,使得细胞内的Ca2+水平超过毒性阈值,最终诱导细胞死亡[89],这些研究成果揭示了AD细胞内线粒体功能障碍与Ca2+紊乱具有直接关系。

但是,还有其他研究表明了PS有一些功能的发挥不依赖于γ分泌酶,而是通过转化为内质网上的Ca2+被动泄露通道来发挥作用[89-91]。虽然这一假说在起初提出时就备受质疑[92],但是却在后来的动力学模型中得到了再次验证[93]。PS可以转化为Ca2+通道的这一功能并不绝对,它仅部分体现在了FAD相关的基因突变模型中。比如说,PS1突变的经典模型——M146V位点突变,该位点突变可以削弱Ca2+漏通道的功能;而当另一种PS突变类型——外显子9被删除时,反而可以增强ER的Ca2+漏通道功能[94]。Nelson等[91]还发现AD患者的临床表现与FAD基因突变中内质网Ca2+漏功能的变化之间关系密切。另有证据显示D385位点的突变比D257位点的突变调节Ca2+通道功能更明显[12,95]。

4 内质网与淀粉样β蛋白(Aβ)

虽然Aβ对胞内Ca2+平衡状态的影响已经获得了确认,但是胞内Ca2+稳态是否对Aβ产生影响现在还存在较大争议。一些学者们认为胞内Ca2+的持续升高可以加快Aβ的形成,如果这一学说成立,那么减少ER内Ca2+的释放就能够对抗Aβ神经毒性,成为一种新的神经保护策略[96-98]。在AD患者早期阶段的脑中以及AD转基因鼠模型中都发现RyR表达活跃和活性增加,这种改变会加快AD的进展[77,99,100]。Querfurth等[101]学者利用HEK293细胞证实应用咖啡因激活RyR后可升高胞内Ca2+水平进而促进APP分解出有神经毒性的Aβ片段。有学者利用AD患者脑组织进行研究证实RyR的减少与Aβ的沉积关系密切[100]。在Tg2576小鼠脑中应用丹曲洛林——RyR的抑制剂,能够减少胞内外的Aβ累积从而减轻小鼠的神经功能障碍。这一保护功能是通过降低胞内Ca2+浓度从而抑制β、γ分泌酶的活性以及APP的磷酸化实现的[102]。然而,仍然有证据质疑这一结论。如果敲除神经元的RyR3,Aβ反而会增加,且研究者们发现在丹曲洛林长期治疗的转基因AD小鼠脑中的Aβ水平较用药前高[103,104]。

同样,IP3R的变化也会对Aβ产生影响。Cheung等[105]学者发现当敲除细胞的IP3R时,Aβ的产生也会相应减少;Pierrot等[106]学者则证实单独增加ER释放Ca2+还不足以使胞内Aβ的产生增加,还需要协同胞外钙内流;Koran等[107]学者的研究表明CACNA1C与RyR3有密切联系,而这种相互作用会最终导致Ca2+紊乱以致Aβ的产生和沉积增加。

有研究发现胞内Ca2+水平的增加可以减少Aβ的产生。IP3R在Aβ产生过程中发挥的作用存在争议。有实验发现AD患者脑中的IP3以及IP3R的含量反而较正常水平下降[108];胞内Ca2+水平升高反而可以减少Aβ的产生,抑制APP的淀粉样水解[109]。最近的一项研究还证实了STIM1过度表达可使SOCE介导的Ca2+向胞内内流增加,但却会抑制Aβ的产生[110]。同时,有大量研究均表示在AD动物模型的海马以及AD患者脑内均发现了STIM2含量下降的表现[111-113],而突变的PS可能具有清除STIM的功能[114]。因此,此机制尚需进一步研究和讨论。

另外,ER作为蛋白质形成和折叠的重要场所,对Aβ的产生和聚集也起着重要作用。如ERAD(endoplasmic-reticulum-associated degradation)是识别和转运错误折叠蛋白的一个多级过程,它既保证了细胞内mRNA正确翻译,又可识别并降解错误折叠蛋白,是细胞的“蛋白质质量监控中心”[115]。最近的一项利用基因组学的研究发现,ERAD的一个关键组成membralin的减少会促进Aβ的沉积、树突棘的丧失以及神经元死亡进而导致患者记忆功能的逐渐丧失[116]。

5 结论

由于神经系统本身具有的复杂性,Ca2+信号是否是AD的始动环节尚存在较大的争议,该机制与其他经典机制之间的关联也需要进一步解开。关于内质网中Ca2+紊乱与阿尔茨海默病之间的明确关系也尚未具体系统地阐述,但在AD患者脑中新的位于细胞和细胞器中Ca2+信号通路的不断发现,均表明ER上的Ca2+信号通路在AD病理进程中起到了重要作用。同时,以上关于AD患者神经细胞内内质网膜上IP3R和RyR、神经细胞膜上NMDAR和VGCC、钙离子漏通道等通路的异常调控导致的Ca2+超载与AD的结构和功能损伤密切相关的研究,都将为Ca2+紊乱学说提供进一步的证据。这或许会为未来攻克AD提供新的指导理论。