非洲猪瘟病毒核酸检测技术与应用进展

庄金山 ，邓均华 ，田克恭

（1.洛阳普泰生物技术有限公司，河南 洛阳 471000；2.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000）

近年来，我国养猪业处于高速发展时期，年出栏肉猪7亿头左右，占世界生猪产量的一半以上，养猪业的稳定发展对我国农业乃至整个国计民生的稳定至关重要。非洲猪瘟（African swine fever，ASF）在我国暴发以来，疫情迅速传遍全国，给我国养猪业生物安全防控体系提出了严峻挑战，该病也是世界动物卫生组织（OIE）确定必须通报的六种重要猪病之一，我国将此病列为一类动物疫病[1]。

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是有囊膜的双链DNA病毒，根据p72基因的差异，可将ASFV分为至少22个基因型[2]，我国流行的毒株为基因Ⅱ型[3]，目前，ASF尚无疫苗上市。OIE推荐的ASF的实验室诊断方法有两类：一类是病原鉴定，包括血细胞吸附试验（haemadsorption，HAD）、荧光抗体试验（fluorescent antibody test，FAT）和聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）；另一类是血清学试验，包括酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、间接荧光抗体试验（indirect immunoinfluscent assay，IFA）、免疫印迹试验（immunoblotting test, IBT）。其中，以PCR原理为基础的核酸检测方法因其快速、高灵敏度、高特异性等特点，被快速广泛地推广应用，在ASF的诊断、感染监测、养殖复产过程中的生物安全评价等方面具有重要意义。

文章从核酸检测技术的原理与特点、ASFV核酸检测技术的应用及核酸检测新技术的应用展望等3个方面进行总结和分析，以期为养猪企业在ASF防控和核酸检测技术平台建立方面提供参考借鉴。

1 常用的核酸检测技术与特点

核酸是生物遗传物质的载体，由核苷酸聚合而成，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）；核酸是重要的生物标志物，与生物的遗传进化密切相关，也是当前疫病病原微生物检测的目标之一。自1953年DNA双螺旋结构的发现、中心法则的提出和不断完善为现代核酸检测技术的建立与发展奠定了基础；早在1961年，Hall等建立了利用探针和靶序列在溶液中进行分子杂交的方法，随后建立的Southern blot和Northern blot方法是对DNA和RNA检测的经典方法；1977年，Frederick Sanger发明了“双脱氧终止法”完成了经典的基因测序方法（一代核酸测序）的建立，开启了核酸测序时代的序幕；1983年，Mullis发明的核酸体外扩增的PCR技术极大提升了核酸检测技术的敏感性和特异性。分子杂交、基因测序和PCR等三种技术是当代核酸检测技术基础，其中PCR技术及其衍生的核酸检测技术在临床诊断中应用最为广泛。

PCR技术发展历程可分为三个时代。第一代PCR技术是由Cetus公司和加利福尼亚大学1985年联合创建，通过PCR扩增仪进行扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，操作繁琐、容易交叉污染，且灵敏度和特异性较低，只能用于定性或半定量检测。第二代PCR技术是最早由美国ABI公司推广的实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR），该方法通过增加荧光标记的特异性核酸序列作为探针，极大地提高了检测的特异性和敏感性，不仅能进行定性分析，也可进行定量分析；然而，qPCR在定量检测方面仍然存在低拷贝核酸量检测的稳定性和绝对定量的准确度问题。数字PCR（digital PCR，dPCR）是近年来迅速发展的一种定量分析技术，被认为是第三代PCR技术，该技术可实现不依赖扩增曲线的循环阈值（Ct）判定结果，具有较好的准确度和重复性，且可实现绝对定量分析；2006年，Fluidigm公司率先推出基于芯片的dPCR仪，随后，Life Technologies公司和Bio-Rad公司也推出了各自的商业化的dPCR仪。

主流的PCR技术所匹配的设备、试剂和耗材价格较昂贵，操作过程繁琐，更适用于科研和大型医学检测实验室，对于临床即时检测（point-of-care testing，POCT）需要更为便捷、性价比更高的产品和技术。对流PCR（convective PCR，cPCR）是近年来发展起来的一种核酸快速检测技术，最早由Benett等于2001年提出，其原理是通过在毛细管的上下两端进行加温，通过温度差异形成毛细管中液体密度的差异，无需外部的循环泵即可形成循环流动，通过样品自身的流动完成PCR的过程[4]。2017年，第一台用于商业化的8孔cPCR扩增仪问世[5]。这种原理使PCR反应的变性、退火、延伸能够在同一时间内进行，省去了PCR扩增时各个阶段的升降温时间（图1 B），也降低了仪器的能耗，与传统的实时荧光PCR仪相比，cPCR扩增仪体积大幅缩小，重量仅有4.5 kg左右（图1 A），操作界面便于理解，单孔可独立控制，便于现场样品的随时检测（图1 C），反应仓操作便捷，双层反应仓盖，可减少荧光信号的损失（图1 D）。洛阳普泰生物技术有限公司已在兽医领域首次推出基于cPCR技术检测ASFV的便携式POCT设备和快速检测试剂盒[6]。

等温扩增技术也是近年来发展起来的一类核酸快速检测技术，包括多种等温扩增技术，如环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequencebased amplification，NASBA)、依赖解旋酶扩增(helicase-dependent amplification，HDA)、滚环核酸扩增(rolling circle amplifi cation, RCA)、链替代扩增(strand displacement amplification, SDA)等[7]，在临床诊断领域以LAMP和RPA应用最为广泛。这些方法的共同特点是可在恒温条件下通过利用不同功能的DNA聚合酶实现目的核酸模板的快速扩增，降低了反应体系的温度要求[8]，同时结合荧光探针技术，保证了检测的灵敏性和特异性，反应体系温度的降低，也简化了传统的荧光定量PCR对仪器工作环境的苛刻要求，更有利于现场检测的应用。

2 ASFV核酸检测方法的应用

国内外研究人员很早就建立了针对ASFV核酸的检测方法。早在1992年[9]，瑞士研究人员就建立了针对ASFV基因组核酸的套式PCR方法，对猪的脾脏和血清进行了检测，并使用人工合成的质粒DNA作为对照品；2003年，西班牙研究人员[10]建立了基于凝胶电泳的热启动PCR方法，该方法明显提升了对ASFV核酸的检测灵敏度，扩大了临床样品的检测范围，可检测组织、血清及经过EDTA处理过的血液样品、甚至变质或腐败的组织，灵敏度优于当时OIE推荐方法；该研究也结合了限制性内切酶酶切的方法对扩增产物酶切分析，省去了测序鉴定的步骤。同年，英国研究人员King[11]等也建立了针对ASFV VP72 基因序列的TaqMan荧光探针法，大幅提升了检测灵敏度，缩短了检测时间，可在封闭的反应管内进行结果的判定，省去了可能存在污染的琼脂糖凝胶电泳的步骤，上述两种方法也是当前OIE推荐的方法。

荧光定量PCR方法与基于凝胶电泳的传统PCR方法相比具有的明显优势而被很多科研机构所认可。2007年，国内学者李维彬等[12]建立了针对ASFV VP72基因序列的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，使用质粒作为参比模板，检测灵敏度可达到100个拷贝。2010年，郭少平等[13]针对ASFV K205R基因设计了引物和探针，建立了实时荧光定量PCR方法，对质粒模板的检测灵敏度可达10个拷贝。2009年，江彦增等[14]针对ASFV P72基因建立了LAMP的检测方法，可在30 min内完成扩增反应，对质粒模板的检测灵敏度可达到5个拷贝。2016年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究人员与瑞典、乌干达等国的研究人员联合建立了一种新的荧光定量PCR方法，用于检测ASFV VP72基因序列，检测灵敏度可达到60个拷贝[15]。除了荧光定量PCR方法外，环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组聚合酶等温扩增（RPA）等技术也有被应用于ASFV核酸检测的报道。2017年，哈登楚日亚等针对ASFV P72基因建立了RPA的检测方法，在39 ℃、20 min内即可检测到10个拷贝的质粒DNA模板[16]。

正是基于ASFV核酸检测的储备性研究，自2018年8月ASF传入我国之后，国内企业和相关研究机构快速启动了ASFV核酸检测产品研发，并快速推出了一系列的产品。2019年1月和6月，中国动物疫病预防控制中心先后两次公布了非洲猪瘟现场快速检测试剂的评价结果，最终34个核酸检测产品通过了评价，包括28个荧光PCR类和6个等温扩增类产品。其中，除了荧光PCR技术外，基于荧光探针法和PCR技术原理一些新的技术和工艺在这些产品中得到应用，如免提取核酸技术、cPCR、微流控技术、LAMP、RPA、产物降解技术、冻干工艺等[6]。随着国家推动第三方检测机构参与ASF的检测并推动屠宰和养殖企业建立检测实验室进行自检，核酸检测技术已被广泛地应用于ASF生物安全防控的各个环节。

当前，ASFV核酸检测试剂盒的广泛应用，一方面得益于核酸检测试剂和工艺的研究成果，另一方面也得益于扩增仪器的小型化和成本的降低；ASF疫情的暴发，使养殖企业和相关机构对核酸检测平台的建设高度重视，核酸检测仪器、试剂盒的应用空前普及，在ASF的诊断、监控和复产过程中发挥了重要的作用，但检测质量还有很大的提升空间，样品采集、样品处理、核酸提取与纯化、人员技术水平、操作环境的交叉污染等多种因素影响着核酸检测技术的稳定应用。未来，在提升检测的灵敏性和特异性的基础上，提升产品操作的便捷性、可靠性将是ASFV核酸检测产品研发的趋势之一。

3 新技术在ASFV核酸检测领域的应用展望

当前，qPCR技术是ASFV核酸检测主流技术，但cPCR、LAMP、RPA等技术也显示了强大的竞争力，随着生物技术和机电技术的发展，核酸诊断试剂的发展和相配套的仪器的发展相辅相成，众多新的产品形式不断涌现，但整体方向是向着更准确和更便捷两个方向发展。

dPCR是一种新型的核酸分子绝对定量技术，Wu Xulong等建立了ASFV核酸检测的dPCR方法，检测限可达10个拷贝/反应，比实时荧光定量PCR检测灵敏度高10倍左右[17]，在ASFV传播途径分析和环境样品的监测均有重要的作用；虽然当前dPCR技术所需的设备还比较昂贵，但随着技术的发展，dPCR设备已经实现了国产化，未来的应用成本将会进一步降低。牛津纳米孔测序技术也显示出其在ASFV 核酸检测方面的应用潜力，O`Donnell等利用便携式牛津纳米孔测序仪结合ASF快速分析测序软件（ASF-FAST），可在10 min内快速从临床样本中进行ASFV基因组测序分析，从而达到快速准确诊断的目的[18]。

核酸提取和扩增一体化技术是核酸检测技术发展的另一个方向，已经广泛应用于人医检测领域，如Cepheid公司的GeneXpert system、Atlas Genetics公司的io检测平台、BioFire公司的FilmArray、GenePOC公司的revogenne、北京博晖创新公司的GenPlex®等均可实现“样品进，结果出”。这些产品和技术平台融合了微流控、冻干、恒温扩增、电化学等在内的多种技术和工艺，很好地解决了传统核酸检测方法试剂保存难和操作流程繁琐的问题。

在兽医领域，试剂和设备的成本是限制新技术推广应用的重要原因之一，如何降低试剂和设备的成本应该是未来需要解决的问题。因兽医诊断试剂市场容量较小，兽医领域的核酸诊断试剂公司在新技术方面的投入较少，而拥有更多技术储备的公司多集中在人医领域。未来，二者的技术资源和市场资源整合或许能为兽医领域核酸诊断试剂的发展提供机遇。此外，试剂工艺研发和POCT设备研发可加快核酸检测产品在兽医检测领域的应用，如核酸检测试剂全预混冻干工艺[19]、便携式核酸提取+扩增一体机设备、生物传感器技术[20]等可以大大降低基层兽医人员进行检测操作的技术难度。

4 小结

ASF的暴发推动了核酸检测技术在畜牧业生物安全防控体系中的应用。未来，提升行业技术人员操作水平的同时，构建POCT化的核酸检测平台将是未来核酸检测技术在畜牧业生产中发挥作用的主要方向。