柚皮苷微乳制备工艺研究*

徐坤勇，郭建忠，颜 娟，韵国萍

（1.河北省张家口市第一医院药剂科，河北 张家口075061；2.河北北方学院附属第一医院药剂科，河北 张家口075061）

柚皮苷又称柚苷、柑橘苷，来源于芸香科柑橘属植物柚、葡萄柚未成熟或近成熟的干燥果皮，是一种天然的黄酮类化合物[1]。柚皮苷具有多种生物学活性，包括抗过敏反应[2]，抗氧化，调血脂，抑制杂环胺类物质等致突变性，抗癌，预防与治疗胃溃疡，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希杆菌及某些真菌有抑制作用，抗炎，对某些毒物有拮抗作用，解痉，镇痛，改善微循环和软骨组织细胞功能，降低毛细血管通透性和骨关节病变率等[3]。微乳剂可缓慢释放药物，提高药物生物利用度，达到协同增效和减毒的目的[4]。本研究中拟利用柚皮苷的生物学活性，制备柚皮苷微乳，并对其外观、形态、粒径表征和稳定性进行观察，为柚皮苷制剂的进一步开发奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

JB-2型恒温磁力搅拌器（上海智光仪器仪表有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度及Zeta电位测定仪（英国Malvern公司）；SKY-2102C型恒温摇床（常州金坛精达仪器制造有限公司）；LG16-B型高速离心机（北京雷博尔离心机有限公司）；752型紫外可见分光光度计（上海恒平科学仪器有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；AE/240型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司，精度为万分之一）。

1.2 试药

柚皮苷对照品（重庆对照品科技有限公司，批号为110722-201312，纯度≥98%）；柚皮苷（实验室自制，纯度≥90%）；丙二醇辛酸酯（法国Gattefosse公司，批号为58748-27）；油酸乙酯（批号为Z16D8Y50961），肉豆蔻酸异丙酯（IPM，批号为Y20J8S40186），均购自上海源叶生物科技有限公司；聚山梨酯80（Tween80，天津市光复精细化工研究所，批号为20171101）；聚氧乙烯35蓖麻油（EL-35，批号为D1216A），聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40，批号为S0824A），均购自德国BASF公司；聚乙二醇400（PEG400，批号为20121201），无水乙醇（批号为20171103），均购自西陇化工股份有限公司；1，2-丙二醇（南京威尔化工有限公司，批号为20170901）；甘油（天津市恒兴化学试剂有限公司，批号为20160522）；甲醇、乙酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 油相选择

色谱条件与系统适用性试验[5-7]：色谱柱为Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为36%乙酸-甲醇-水（4∶49∶51，V/V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为283 nm；柱温为室温；进样量为10μL。理论板数按柚皮苷峰计应不低于3 000。

油相中柚皮苷平衡溶解度：将过量的柚皮苷分别加入含有不同油相（IPM，油酸乙酯、丙二醇辛酸酯）的离心管中，漩涡振荡5 min，混合均匀，超声处理30 min，置40℃恒温摇床中水平振摇48 h以达平衡，4 000 r/min离心10 min，取上清液，用适量甲醇稀释，用0.45μm微孔滤膜滤过，依法进样测定。结果显示，柚皮苷在油酸乙酯中的平衡溶解度最高（4.76 g/L），故选择油酸乙酯为油相。

2.2 表面活性剂与助表面活性剂配伍试验

分别以Tween80，EL-35，RH-40为表面活性剂，以1，2-丙二醇、PEG400、甘油与无水乙醇为助表面活性剂，固定总质量为1.0 g，将油酸乙酯、表面活性剂与助表面活性剂按质量比1∶3∶1混合，40℃恒温水浴搅拌均匀，得油相混合物，逐滴滴入4 mL水，形成微乳。取微乳，4 000 r/min离心15 min，静置1 h，观察分层现象。按公式物理稳定性参数（KE）=（A0-A）/A0测定微乳的KE。式中，A0和A分别为原微乳和原微乳离心后下层液经同倍稀释后在同一波长下的吸光度。在相同条件下，KE越小，微乳越稳定。以283 nm为检测波长，采用紫外分光光度法考察表面活性剂与助表面活性剂的配伍情况，结果见表1。Tween80和1，2-丙二醇、甘油制备的微乳经离心后均已分层，当Tween80，EL-35，RH-40分别为表面活性剂，PEG400、无水乙醇为助表面活性剂时均能形成澄清透明的微乳，KE较小，且4000r/min离心15 min后无分层，常温避光静置24 h后乳化稳定。通过配伍试验初步选择Tween80，EL-35与RH-40为表面活性剂，选择PEG400、无水乙醇为助表面活性剂。

表1表面活性剂与助表面活性剂的配伍试验结果

2.3 微乳制备及伪三元相图绘制

按一定比例将表面活性剂与助表面活性剂混匀，作为混合表面活性剂，再将油相加入混合表面活性剂中，混匀，40℃恒温磁力搅拌器搅拌（转速为100 r/min），混匀，同时向混合体系中缓慢滴加水，观察体系由清至浊或由浊至清的现象。以流动性好、外观均一透明及有丁达尔效应为微乳形成的判断标准。以混合表面活性剂为1个顶点，以水相和油相为另外2个顶点，根据形成微乳临界点时各组分所占比例确定在相图中的位置，采用Origin8.5软件绘制伪三元相图，确定微乳区的面积[8]。

2.4 微乳处方筛选

空白微乳制备：固定油相为油酸乙酯不变，分别选用Tween80，EL-35，RH-40为表面活性剂，选用PEG400、无水乙醇为助表面活性剂，表面活性剂与助表面活性剂质量比（Km）分别为1，2，3，按2.3项下方法制备空白微乳，观察并记录在临界点时各组分所占比例。

表面活性剂选择：分别以Tween80，EL-35，RH-40为表面活性剂，以无水乙醇为助表面活性剂，Km取3，制备混合表面活性剂，按2.3项下方法绘制微乳的伪三元相图，确定微乳区，结果见图2。可见，当EL-35为表面活性剂时微乳区面积最大，故选择EL-35为表面活性剂。

助表面活性剂选择：固定表面活性剂为EL-35，其Km为3，分别以PEG400、无水乙醇为助表面活性剂，按2.3项下方法绘制微乳的伪三元相图，确定微乳区，结果见图3。可见，当无水乙醇为助表面活性剂时微乳区面积最大，故选择无水乙醇为助表面活性剂。

Km值选择：以表面活性剂为EL-35，以无水乙醇为助表面活性剂，以Km分别为1，2，3制备混合表面活性剂。按2.3项下方法绘制微乳的伪三元相图，确定微乳区，结果见图3。可见，当Km=3时微乳区面积最大，故选择Km为3∶1。同时，油酸乙酯与混合表面活性剂质量比为1∶4时能形成稳定的微乳，故确定油酸乙酯与混合表面活性剂质量比为1∶4。

图1不同表面活性剂绘制的伪三元相图

图2不同助表面活性剂绘制的伪三元相图

图3不同Km绘制的伪三元相图

2.5 微乳制备

乳化温度选择：分别称取油酸乙酯0.2g、EL-350.6g与无水乙醇0.2 g，按2.3项下方法分别于40，50，60℃恒温磁力搅拌（转速为100 r/min）下逐滴滴入4 mL水，制备空白微乳。以微乳外观性状、透光率为考察指标，观察乳化温度对乳化效果的影响，结果见表2。随着乳化温度的升高，微乳透光率逐渐降低。40℃乳化时所得微乳澄清透明，常温静置24 h仍保持稳定，无分层现象。故选择乳化温度为40℃。

表2乳化温度对乳化效果的影响（n=3）

稀释倍数（W水∶W油）确定：分别称取油酸乙酯0.2 g、EL-35 0.6 g与无水乙醇0.2 g，按2.3项下方法分别滴入1，4，8，16 mL水，制备空白微乳。以微乳外观性状与透光率为考察指标，观察不同稀释倍数对乳化效果的影响，结果见表3。随着稀释倍数的增大，微乳的透光率逐渐升高。当水≥4 mL（即稀释倍数≥20倍）时，均能形成澄清透明的微乳，透光率均＞90%，常温静置24 h仍保持稳定。故选择水与油的质量比为20∶1。

表3稀释倍数对乳化效果的影响（n=3）

2.6 空白微乳处方确定

由筛选结果可知，油酸乙酯为微乳油相，EL-35为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，Km为3。确定空白微乳处方组成比例为油酸乙酯4%，EL-35 12%，无水乙醇4%，水80%。

2.7 柚皮苷微乳处方确定

称取适量柚皮苷，加入油酸乙酯中，按2.3项下方法制备含柚皮苷0.5%，1%，2%的微乳，于4 000 r/min离心15 min，于离心前后分别测定微乳中柚皮苷的含量。结果离心前后柚皮苷含量无明显变化，所制备的柚皮苷微乳稳定性良好。为了保持更高的载药量，故选择含2%柚皮苷的微乳为目标处方，进而确定柚皮苷微乳处方组成比例为柚皮苷2%，油酸乙酯4%，EL-35 12%，无水乙醇4%，水78%。

2.8 柚皮苷微乳表征

性状：黄棕色透明、流动性好的低黏度液体。

形态观察：取柚皮苷微乳适量，用水稀释20倍，滴在铜网上，静置10 min，用滤纸吸走多余的水，用2%磷钨酸（pH7.4）溶液负染10 min，自然挥干，置透射电子显微镜下观察，结果见图4。该微乳颗粒呈圆球形，分布相对均匀，基本无粘连现象。

图4 柚皮苷微乳透射电镜图（×80 000）

粒径分布与Zeta电位测定：取适量柚皮苷微乳，加水稀释，超声分散，采用激光粒度测定仪于25℃测定柚皮苷微乳粒径分布，结果见图5；Zeta电位分析仪测定电位分布，结果见图6。柚皮苷微乳的平均粒径为（32.78±0.30）nm，均在10～100 nm之间；Zeta电位平均值为（-47.86±4.71）mV。

pH测定：称取柚皮苷微乳0.5 g，加水稀释100倍，于25℃测定pH，结果为5.37。

图5柚皮苷微乳的粒径和Zeta电位分布

2.9 初步稳定性考察

高温试验：取适量柚皮苷微乳，密封保存于带塞西林瓶中，60℃恒温水浴锅中分别放置5 d和10 d，考察柚皮苷微乳的稳定性，结果见表4。放置5 d，微乳已变浑浊，透光率明显下降，表明柚皮苷微乳在高温时质量不稳定。

表4 60℃稳定性试验结果（n=3）

常温留样考察：取适量柚皮苷微乳，密封保存于带塞西林瓶中，在温度25℃、相对湿度75%条件下分别放置1，2，3，6个月，定期考察，结果见表5。第6个月柚皮苷微乳仍保持澄明，未见分层，透光率及含量与第0个月比较均无明显变化。

表5常温留样考察结果（n=5）

3 讨论

柚皮苷单体具有良好的成药性[9]。目前，有代表性的柚皮苷制剂为片剂[10]，但存在首过效应，生物利用度不高[11]。微乳为良好的药物载体，可提高药物的生物利用度[12]。因此，本研究中制备柚皮苷微乳考察其表征形态及稳定性，为柚皮苷制剂的进一步开发提供参考。

油相是微乳的重要组成部分，本研究中通过平衡溶解度筛选油相。伪三元相图是研究微乳体系的基本工具，微乳区域面积与微乳稳定性关系密切[13]。EL-35含聚氧乙烯基团，为非离子型表面活性剂，可降低界面膜的表面张力，有较好的乳化性能，不易受酸碱的影响，毒性小，溶血性低[14]，且形成的微乳区面积较大，故选择EL-35为表面活性剂。助表面活性剂可调节表面活性剂亲水亲油平衡值，同表面活性剂降低界面张力有协同作用，增加微乳的流动性，增强界面间的柔性，且因短链醇类能增大药物的溶解度，减小微乳颗粒，乳化性能好，常作为助表面活性剂使用[15]，故本研究中选择无水乙醇作为助表面活性剂。

高温试验结果表明，柚皮苷微乳在60℃放置5 d后，外观明显浑浊，这可能与柚皮苷在热水中溶解度急剧升高，柚皮苷从油相中转入水相，破坏微乳结构有关，表明柚皮苷微乳制剂应常温或低温贮藏。由常温留样考察试验结果可知，柚皮苷微乳放置6个月后未见分层，透光率和含量未见明显变化，表明柚皮苷微乳在25℃放置6个月稳定性良好。

综上所述，本方法所制备的柚皮苷微乳可为扩大柚皮苷的应用奠定基础，但能否满足临床需求，提高药物疗效，还需要通过后续试验考察和验证。