柳州地区15 个常用STR 基因座的遗传多态性及突变分析

许泽辉 罗世强 唐宁 王秋华 钟青燕 袁德健 蔡稔 崖娇练 严提珍（通讯作者）

（柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室柳州市妇幼保健院医学遗传科 广西 柳州 545001）

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是由2 ～6个核苷酸组成并存在于真核生物基因组中的DNA 串联重复序列，具有高度多态性和孟德尔共显性遗传规律的特性，是目前广泛应用于法医物证学检验的多态性遗传标记。而相应开发的聚合酶链式反应-短串联重复（polymerase chain reaction-short tandem repeat，PCR-STR）检测技术是国际法医学界一项技术手段。AmpFLSTR ™ Identifiler ™ Plus 试剂盒在目前的亲子鉴定实践中得到了较广泛地应用，它是采用五色荧光技术检测15个STR 基因座和一个性别位点。虽然STR 基因座具有高度的遗传稳定性，但物种的发展同样不可避免发生突变。在亲子鉴定中STR 基因座发生突变的现象近几年均有报道[1-4]。本文作者通过亲子鉴定案例回顾性分析，对AmpFLSTR ™ Identifiler ™ Plus 试剂盒15 个STR 位点进行观察，分析了本地区STR 基因座的突变情况，为今后的亲子鉴定提供频率计算的基础。现报道如下。

1.资料与方法

1.1 样本材料

2013 年3 月—2017 年10 月7450 例来源于实验室日常检案且结论为肯定亲权关系的家系样本，其中三联体家系2319 例，二联体家系5131 例，样本类型有血滤纸、带毛囊毛发、羊水、绒毛等。

1.2 DNA 提取

采用Chelex-100 法提取样本基因组DNA。

1.3 基因分型

常规采用AmpFLSTR ™ Identifiler ™ Plus 试剂盒（美国life 公司）对基因组DNA 直接PCR 复合扩增，若出现疑似突变现象，二联体父女或母女，二联体父子或母子，三联体分别采用X-STR、Y-STR、PowerPlex24 等进一步验证。扩增产物使用ABI3500Dx 遗传分析仪（美国life 公司）按相应仪器使用说明书进行扩增产物片段分析，应用GeneMapper ID-X v1.4 软件进行基因分型分析。

1.4 突变基因座、来源、步数的确定

用AmpFLSTR ™ Identifiler ™ Plus 体系进行检测，若基因座上遗传位点有1 ～2 个违反遗传规律，参照“亲权鉴定实验室规范及技术标准建议”计算累计亲权指数（paternity index，PI）、增加X-STR 或Y-STR 检测[5]。若累计PI ＞10000，且X-STR 或Y-STR 符合遗传规律，则判定有亲权关系，违反遗传规律的基因座则视为突变位点。突变等位基因来源的确定[6]，将子代发生突变等位基因座与其亲代父方或母方的等位基因相差最小步数的等位基因视为突变等位基因来源方；突变等位基因座的增加或减少的多少为突变步数，若同时存在同步数的增加或减少可能，则视为不确定来源方，本研究增加或减少一步突变以+1、-1 表示，增加或减少二步突变以+2、-2表示，依次类推。若突变为纯合子，要排除检测试剂盒的原因而导致实验错误。

1.5 统计及分析

根据STR 基因座突变率的计算公式：STR 基因座的突变率=突变STR 基因座数/（双亲案例数×2+单亲案例数）来计算每个STR 基因座突变率，由直接计数法得出具有STR 基因座突变的案例数，并分析相关影响因素。并使用χ2检验，来评估各统计量是否存在显著差异。

2.结果

2.1 STR 基因座突变分析结果

统计7450 例判定为亲子关系的案例，三联体亲子鉴定有2319 例案例，单亲二联体亲子鉴定有5131 例案例，共观察到9769 次减数分裂。在15 个检测基因位点中观察到一个STR 位点突变有109 例案例，突变位点涉及到13 个基 因 座（D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1P O、D3S1358、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、D18S51、D5S818 和FGA），其中以FGA 基因座的突变率最高（1.84‰），突变率最低基因座为D2S1338，该所有检测基因座中仅T H01和TPOX 没有检测到突变情况，其余都检测到有突变情况。根据文献分别对观察到的109 例突变率进行计算[7-8]，STR 基因座突变率见表1。

表1 STR 基因座突变率汇总

2.2 STR 基因座突变步数

观察并比较同一家系突变基因座的等位基因型，STR基因座突变步数情况见表2。三联体突变有34 个案例，二联体突变75 个案例，其中一步突变101 次（92.66%），二步突变1 次（0.92%），三步突变4 次（3.67%），四步突变3 次（2.75%）。

表2 STR 基因座突变步数情况

2.3 突变等位基因来源

109 个案例中检测到突变等位基因座来自父源的有98 例，占突变基因座的89.91%，来自母源的9 例，占突变基因座的8.26%，无法确定来源2 例，占突变基因座的1.83%。父源突变率与母源突变率比例为98：9，约10：1（χ2=74.02，P＜0.01）。见表3。

表3 STR 基因座突变来源汇总

3.讨论

3.1 STR 基因位点的突变频率分析

基因突变一般是DNA 在复制过程中，DNA 聚合酶滑动造成子代重复序列中核心序列的改变引起的。本研究通过对柳州地区7450 例亲子鉴定案例的分析，发现109 例案例的基因座有突变发生，突变率在0 ～1.84‰之间。分析显示FGA 基因座突变率较高，其次是D8S1179、D18S51、D19S433、vWA。突变频率最高的FGA 基因座所占突变案例比例为1.84‰，与文献报道的FGA 基因座突变率最高一致[9]，分析认为本地区少数民族人口比例多，不同地区人群突变存在差异性。这表明不断累积不同地区人群的突变数据并共享数据，可以更好地为法医学亲子鉴定服务。据李成涛等[10]分析认为STR 基因座核心序列重复次数越多，其基因突变率相对越高，本研究15 个基因位点中基因突变率最高的FGA 其重复范围高达12.2 ～51.2。相对于等位基因重复范围较小的基因座TH01 和TPOX，在本次没有发现突变现象，也证明了等位基因范围越小，突变率越低，所以在亲子鉴定选取STR 位点时应将突变频率和人群特异性的因素考虑在内。

3.2 STR 基因位点的突变模式分析

在本次109 例突变案例中，一步突变101 例，占92.66%；二步只有1 例，占0.92%；三步突变3 例，占3.67%；四步突变4 例，占2.75%。未发现有五步或更多突变情况。同时发现一步突变为主要的突变形式，三步以上的突变，发生突变的子代或亲代基因座都为纯合子，且仅出现在D8S1179 基因座等位基因。本次使用不同试剂盒检测验证，但没有进行基因测序，不可以排除基因座丢失的可能性。对D8S1179、D18S51 等位基因出现不符合遗传规律的现象，且基因座为纯合子时，要特别注意，需进一步进行分析验证。

3.3 STR 基因位点突变的性别差异

根据多位学者报道[1-4]，基因座突变来源主要是来自父源，母源突变比例较低。本次来自父源的突变例数所占突变例数高达98 例，占89.91%，母源9 例，不确定例数为2 例，父源所占比与母源所占比的比例约为10 ∶1，具有统计学差异，与其他报道的比例相近[1-4，8，9]。一般认为，父源突变率与母源突变率不同的因素，主要是减数分裂次数越多，产生变异概率越大。本次主要人群以二联体为主，且是父子二联体为主，表现为父源性突变率比例明显偏高，与邱平明等[9]报道一致。同时，排除近亲，追加父方或母方样品检测，降低误判风险[9]。

综上，无论对三联体还是二联体，特别是父子二联体进行亲子鉴定时，注意突变现象的存在，尤其注意纯合子及多步突变，而且选取突变率低，稳定的基因座进行检测，配套其他遗传标记试剂相互认证，按各基因座突变率计算亲权指数，累积更多不同地区人群的突变数据，提高亲子鉴定结论判定的准确性。