三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素工艺条件的优化

刘春芬 慕金超

摘要：利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素，并对其发酵条件进行探讨，确定其最佳发酵条件。结果表明，番茄红素最大吸收波长为508 nm;活化的冻干粉菌种在斜面培养基上于25 ℃培养5 d后，呈较好生长状态，菌丝粗壮，孢子生长状态饱满，镜检显示，其个体生长状态良好;扩大培养120 h时孢子数量达到最高峰;发酵至36 h时添加阻断剂效果最好，发酵至72 h时添加增氧剂效果最好。通过发酵条件优化的正交试验发现，三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素的最优发酵工艺为发酵温度25 ℃、pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

关键词：番茄红素;三孢布拉氏霉菌;发酵;工艺条件

中图分类号： TQ920.6;S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）20-0214-04

番茄红素主要存在于植物细胞的有色体中，因具有抗癌、降低心血管疾病发病率、预防动脉粥样硬化、提高免疫力等生理功能，国内外对其研究热度逐年递增，目前国内外生产番茄红素的方法有以下几种：有机溶剂提取法、超临界萃取法、化学合成法等，利用这些方法合成的番茄红素存在化学物残留问题，品质不高。采用生物合成中的微生物合成法，利用三孢布拉氏霉菌发酵产出番茄红素，和其他的方法相比，具有不受季节控制、操作工艺简单、用时短、生产成本较为低廉等优势。另外相对其他几种方法来说，生物合成法可以获得较高的番茄红素得率，是生产番茄红素的一种理想途径。

本试验研究利用生物发酵法生产番茄红素时发酵条件、培养基成分、各类抑制剂等对成品产量及品质的影响，并对工艺进行优化，初步建立通过微生物发酵生物合成番茄红素的基本工艺。

1 试验材料

1.1 试验时间及地点

试验于2019年6—10月进行，试验地点为学院微生物实训中心。

1.2 材料及试剂

GM3.560三孢布拉氏霉（中国微生物菌种保藏中心，编号：ATCC 14059）;玉米粉、玉米淀粉（在超市或农贸市场购买）;番茄红素标准品（CAS：502-65-8，有效成分含量>98%，规格：20 mg/支）;可溶性淀粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、淀粉均为分析纯;琼脂、维生素B1、酵母膏为生化試剂。

1.3 培养基

活化用培养基：磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁 0.5 g、可溶性淀粉15 g、酵母膏4.0 g，溶于 1 000 mL 蒸馏水中，加入琼脂15 g，充分溶解。121 ℃ 灭菌20 min，制备斜面。

扩大培养用培养基：除不添加琼脂外，其他成分同活化用培养基。

发酵培养基：玉米粉40 g、淀粉糖化液40 g、可溶性淀粉50 g、磷酸二氢钾0.5 g、七水硫酸镁 0.25 g、维生素B1少量，溶于1 L蒸馏水中，加热至完全溶解，调节pH值为6.5，分装在10个锥形瓶中标号1～10，冷却备用。

2 试验方法

ATCC 14059→活化→扩大培养→计孢子数→接种至发酵培养基中→发酵→添加阻断剂和增氧剂→发酵条件的优化→发酵醪→过滤→滤液→减压浓缩→成品

2.1 番茄红素最大吸收波长的确定

对番茄红素标准品在480～520 nm范围内进行最大吸收波长的扫描[1-3]，找到番茄红素标准品最大吸收峰，由此确定番茄红素的最大吸收波长。

2.2 番茄红素标准线性范围的确定

取20 mg番茄红素标准品置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，将其作为储备液。用移液管移取1 mL储备液置于50 mL容量瓶中，同样用乙酸乙酯定容至刻度，作为标准使用液。分别吸取标准使用液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL 置于 25 mL 容量瓶中，并用乙酸乙酯定容至刻度，然后于最大吸收波长处分别测定其吸光度，绘制标准曲线。

2.3 菌种的活化及扩大培养

将0.1 mL无菌生理盐水加入到冻干菌粉的安瓿瓶中，振荡成悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移至4支斜面培养基上，在25 ℃培养5～7 d[4-7]。将活化后的菌种接种到扩大培养用培养基中，在25 ℃振荡培养，转速为150 r/min。自培养48 h开始每隔24 h取菌液计数，当培养基中孢子数达109～1010个/mL 时，停止培养，此培养液备用。

2.4 发酵培养

向发酵培养基中接种10%种子液，摇匀，在 25 ℃ 振荡培养，转速为150 r/min[8]。

2.5 阻断剂及增氧剂添加时间的确定

选用烟草废弃物作为阻断剂，在发酵培养24、30、36、42、48 h时分别向1～5号瓶中加入阻断剂007 g，均进行5 d发酵培养。过滤发酵液，弃去滤渣，将滤液减压浓缩，分析确定阻断剂添加时间。以不添加阻断剂为空白对照。

分别在发酵培养的48、60、72、84、96 h时向6～10号瓶中各加入增氧剂30% H2O2 0.5 g，均进行 5 d 发酵培养，分析确定增氧剂最佳添加时间。以不添加增氧剂为空白对照。

2.6 发酵条件的优化

探讨温度（20、25、30 ℃）、pH值（4.5、5.0、55）、发酵时间（4、5、6 d）、接种量（7.5%、10.0%、125%）等因素[9-14]对发酵结果的影响，分析确定采用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的最佳条件。

3 结果与分析

3.1 番茄红素最大吸收波长的确定

如图1所示，番茄红素标准品在508 nm处有最大吸收峰，因此番茄红素的最大吸收波长为508 nm。

3.2 番茄红素标准工作曲线的绘制

采用分光光度计在波长为508 nm处测定标准系列溶液的吸光度，得到如图2所示结果。

3.3 菌种的活化培养

在斜面培养基上于25 ℃培养5 d后的冻干粉菌种呈较好的生长状态，菌丝粗壯，孢子生长状态饱满。图3显示，该菌菌丝非常粗壮且长度较大，菌丝无横膈膜，属于单细胞，具有多个细胞核，未发现假根。

3.4 种子的扩大培养时间

从表1可以看出，从培养48 h开始，随着培养时间的延长，孢子数呈对数递增趋势，到培养120 h时，孢子数量达到最高峰，随后再延长培养时间，孢子数量没有明显的增加，说明此时扩大培养基中营养成分已经较少，代谢产物积累较多，菌体开始由对数生长期转向稳定生长期，新生细胞数与死亡细胞数保持动态平衡，孢子数量出现减少趋势，可以推论，此后霉菌将进入衰亡期，因此，选择在培养120 h时终止培养，得到种子培养液。

3.5 阻断剂添加时间的确定

在508 nm处分别测定减压浓缩后滤液的吸光度[15]，由于测得的吸光度过大，不在番茄红素标准工作曲线的线性范围内，因此测定之前分别将5瓶发酵液稀释2倍，得到图4所示结果。空白对照组发酵5 d后，经测定吸光度为0.295。由图4可见，比较试验组的吸光度与对照组发现，发酵过程中添加阻断剂能有效阻断胡萝卜素的生成，从而使得产物仍为番茄红素。当发酵进行至36 h时添加阻断剂效果最好，因此，选择添加时间为发酵 36 h 时。

3.6 增氧剂添加时间的确定

在508 nm处分别测定减压浓缩后滤液的吸光度，由于测得吸光度过大，不在番茄红素标准工作曲线的线性范围内，因此测定之前分别将5瓶发酵液稀释2倍，得到图5所示结果。空白对照组发酵5 d后，经测定吸光度值为0.287。由图5可见，比较试验组的吸光度与对照组发现，发酵过程中添加增氧剂能有效增加番茄红素的生成量。当发酵进行至72 h时添加增氧剂效果最好，因此，选择添加时间为发酵72 h时。

3.7 发酵条件的优化

3.7.1 发酵温度的确定 由图6可知，在一定范围内当发酵温度升高时，番茄红素的浓度也随之增加;当温度上升到25 ℃时，番茄红素的浓度达到最高值;如果温度继续升高，番茄红素的浓度反而下降，这是因为三孢布拉氏霉菌的最适发酵温度为 25～28 ℃，因此选择25 ℃为其发酵最佳温度。

3.7.2 发酵液pH值的确定 由图7可知，当发酵液pH值上升至5时，番茄红素的浓度达到最高值;继续升高pH值，番茄红素的浓度反而下降，说明三孢布拉氏霉菌的最适发酵pH值在5左右。

3.7.3 发酵时间的确定 由图8可知，当发酵进行至5 d时，番茄红素含量达到最大值，其后，随着时间的延长，产物含量不增反降，可能是由于番茄红素本身不稳定，发生了部分分解，因此，选择最佳发酵时间为5 d。

3.7.4 接种量的确定 由图9可知，在一定范围内番茄红素产量随着接种量增加逐渐递增，当接种量增加到10%时，番茄红素产量达到最大，其后随着接种量的持续增加，番茄红素产量没有明显变化，从经济角度考虑，选择接种量为10%。

3.7.5 发酵条件优化的正交试验结果 由于测得吸光度不在番茄红素标准工作曲线的线性范围内，因此测定之前分别稀释2倍，得到表2所示结果。由正交试验结果可知，影响三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素各因素的主次顺序是C>A>B>D，即发酵时间>发酵温度>pH值>接种量。由k值可得，最佳组合方案为A2B2C2D2，即发酵温度25 ℃、培养基pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

因为最佳组合方案没有在9组正交试验中出现，所以根据正交试验所得到的最佳条件因素做验证试验。经过试验测定得出，在最佳组合方案下吸光度为1.121，对照标准曲线计算得到的番茄红素浓度为 17.61 μg/mL，比正交试验4号的 15.93 μg/mL 大。结果表明，发酵温度25 ℃、培养基pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%是发酵最佳工艺参数。

4 结论

本试验确定了番茄红素的最大吸收波长为 508 nm;活化的冻干粉菌种在斜面培养基上于25 ℃培养5 d后，呈较好的生长状态，菌丝粗壮，孢子生长状态饱满，镜检显示，其个体生长状态良好;扩大培养120 h时孢子数量达到最高峰;当发酵进行至36 h时添加阻断剂效果最好，发酵进行至 72 h 时添加增氧剂效果最好;通过发酵条件优化的正交试验发现，三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素的最佳发酵条件为发酵温度25 ℃、培养基pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

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