红枣分子标记技术应用研究进展

薄璇，侯艳霞，常宁

（山西林业职业技术学院，山西太原 030009）

枣为药食同源的植物，营养丰富，素有“百果之王”的称号，是很多地区重要的经济作物[1-2]。目前枣树分类及优良品种鉴别常用的方法是形态及细胞标记，容易产生同物异名、同名异物的现象[3-4]，使分类及良种鉴别的结果不准确。由于枣树去雄难，人工选育的杂交种不易获得杂交后代，无法有效获得实生苗的父母本信息，使枣树品种改良及定向选育存在较大困难[5]，因此如何快速地对枣树进行分类并鉴别出优良品种，已成为我国枣产业发展亟需解决的问题。

随着现代分子生物学的发展，基于遗传物质DNA 的分子标记技术在枣的指纹图谱构建分类上显示出了优越性。分子标记是一种基于PCR 反应的技术，目前常见的有简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）、随机扩增多态性DNA（Randomamplified polymorphic DNA，RAPD）[6]、区间简单重复（Inter-simple sequence repeat，ISSR）[7-9]及扩增片段长度多态性 （Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术。相比于原来的形态及细胞标记，分子标记具有不受环境季节影响、数量多、共显性等诸多优点。目前DNA 分子标记技术在枣种遗传图谱的构建、亲缘关系、遗传多样性、物种鉴定及育种等方面都有应用。本文就近年来分子标记技术在红枣种质资源及遗传育种中的相关研究进展进行了综述，以期为枣属资源开发及育种提供参考。

1 红枣分子标记概述

分子标记技术为PCR 中的一种，扩增的效率及特异性受到DNA 质量、引物及反应体系浓度的综合影响。因此如何获得高质量的DNA，选择合适的反应体系是分子标记技术首先需要解决的问题。由于分子标记反应是在引物的作用下，以DNA 为模板，dNTPs 为底物，Mg2+与其形成复合物的PCR 反应，扩增效果受到引物、反应体系的影响[10]，因此针对不同的枣属，需要先研究影响分子标记试验的因素。

在红枣分子标记试验中，首先引物的要求是扩增出的DNA 条带清晰、高度多态性。引物开发方面可以直接以枣的组织为材料。陈杰敏等[11]以冬枣叶绿体基因组为材料，设计了11 对冬枣的SSR 引物，利用转录组开发SSR 引物。周军永等[12]利用转录组来源的SSR 分析了李府贡枣基因序列，并分析了单核苷酸及多核苷酸的出现比例，表明李府贡枣中SSR 标记数量多，为SSR 引物及构建枣的遗传结构奠定了基础。谷振军等[13]对南酸枣叶片和果实转录组高通量分析后，根据多个SSR 位点，分析了重复核苷酸所占的比例，以此为基础设计了150 对引物。

其次，红枣分子标记反应体系中物质浓度对扩增效果也存在影响。dNTPs 作为反应的底物，浓度低将降低产量；过高则降低Mg2+的有效浓度[14]。Mg2+浓度过高，出现假阳性非特异性条带[15]；过低则扩增产量较少。引物浓度太低时，扩增产物少；过高时会出现二聚体，或由于模板与引物错配，使条带模糊及产生新的特异性位点[16]。齐靖等[17]以冬枣为试验材料，单因素分析了ISSR-PCR 体系中物质浓度及温度的影响，得到了枣属植物最适的体系。在其基础上，申洁等[18]在2010 年通过正交法分析了反应体系中各物质的浓度对扩增结果的影响，得出浓度对体系的影响顺序为Mg2+＞dNTPs＞Taq 聚合酶=引物，体系Mg2+浓度与齐靖等[17]研究结果一致。王延峰等[19]以陕北11 种枣为材料，研究了Taq 聚合酶单位数、引物浓度对体系的影响，Taq 聚合酶单位数为0.06 U/μL，引物浓度为0.4 μ mol/L，与齐靖等[17]的研究结果一致。

2 分子标记在红枣遗传多样性及育种方面的应用

2.1 构建枣的遗传图谱

构建遗传图谱是遗传学中的重要内容，在此基础上进行基因组的系统研究、品种分类及物种的鉴别选育。目前，已有多个枣基因组学研究表明已构建了一些枣遗传图谱，并已经把部分基因定位于图谱上。如麻丽颖等[20]利用SSR 分子标记技术构建了36 份枣的指纹图谱，该课题组从北京林业大学枣树育种和栽培实践基地搜集到36 个枣品种，进行叶片DNA 提取，利用12 对SSR 引物构建了指纹图谱，聚类分析结果表明枣的遗传多样性相对较小。文亚峰等[21]首先优化了AFLP 的荧光体系，然后对山西省农业科学院果树园艺所及湖南省茶陵县26 个枣的优良品种及1 个酸枣品种进行了遗传图谱分析，在该体系下得到了清晰的不同扩增条带，建立了枣的指纹图谱。

2.2 亲缘关系判断及分类

分子标记技术是通过对DNA 进行聚类分析来实现对枣种亲缘关系及来源的研究，从而对枣进行准确高效的分类。分子标记是一种检测种质资源多样性的有效工具，其数据不仅可以反映物种系统的演化，而且可以对物种和品种亲缘关系进行分类。

分子标记技术可以通过多态性，有效分析样本间的亲缘关系，对样品进行分类。王斯琪等[22]用SSR 鉴定了自然授粉的冬枣1 728 株和530 株“灵宝大枣”子代苗父本。从376 对引物中筛选出了8 对引物，8 对引物在亲本中检测到45 个多态等位条带，PIC 平均为0.71。这说明分子标记技术可以有效地在品种间分析父本的亲缘关系。原勤勤等[23]对38 种枣进行了遗传多样性分析，得出多态性比率为88.47%，这说明38 种枣的遗传多样性丰富。遗传相似系数为0.436～0.880，酸枣与木枣为0.436，说明品种差异较大，亲缘关系远。陈佳瑛等[24]运用ISSR技术对毛叶枣种的亲缘关系进行研究，得出21 个毛叶枣的多态性比率为85.7%，说明遗传多样性丰富。进一步的聚类分析可以将21 个品种分为3 类，并且大多数品种间的相似性大于0.67，说明毛叶枣的亲缘关系较近。王永康等[25]运用AFLP 分析了山西农业科学院果树研究所国家枣种资源圃中的28 个品种，发现5 对引物扩增后的结果多态率为76.16%，聚类分析后能够将品种全部分开。智福军等[26]优化了RAPD 反应体系，以12 对引物分别对5个枣品种进行了鉴定，聚类分析后表明5 个品种可以分为2 类，同一类间各品种具有一定的差异，但也具有一定的相关性，结果表明分子标记技术可以用于分析不同品种间的亲缘关系的相关性和差异性。可见，通过分子标记技术中多态性比率和等位基因的数量可以有效地分析样本间的遗传多样性、品种差异及亲缘关系。

分子标记技术还可以通过分析多态性，对不同地区的样品之间的亲缘关系进行研究，进而反映了物种演化的过程。喇菲菲等[27]利用SSR 分析技术对华北、华中、华东及西北地区的84 个枣品种进行了遗传多样性分析，结果表明华北与华东地区亲缘关系最近。陈晓军等[28]对宁夏中宁、同心、灵武3 个地区栽培的27 个枣品种进行RAPD 分类，结果发现16 条引物可以准确地将其分类，聚类结果表明同心圆枣与灵武长枣、中宁圆枣亲缘关系较远，灵武长枣同中宁圆枣亲缘关系较近。乔勇等[29]应用AFLP 分析了河北省沧县红枣良繁基地和山西省果树研究所国家枣种质资源圃的21 个枣品种，聚类分析结果表明21 个品种可分为6 类，相似系数最大的金丝小枣和无核小枣为0.94，表明两种枣的亲缘关系非常接近。魏天军等[30]利用AFLP 标记分析了宁夏回族自治区的8 个枣树品种品系和原产甘肃靖远县的1 个枣树品种的亲缘关系，利用5 对引物进行分析发现，多态性为27.89%，亲缘关系不丰富。李白云等[31]对7 份宁夏的红枣品种和6 个从区外引进的品种亲缘关系分析，使用5 对引物扩增了13 个宁夏红枣种质资源，得到了301 条多态带（占85.75%），并得出材料间的遗传相似系数为0.376～0.957。聚类分析的13 个品种可以分为5 类，结果表明宁夏地区红枣亲缘关系近。分子标记技术可以有效地分析不同地区之间枣的遗传关系。

2.3 研究遗传多样性

遗传多样性是种质资源利用及保护的基础，分子标记技术可以快速有效地研究某地区枣种的遗传结构。利用分子标记技术开展红枣DNA 水平上的遗传变异研究，同时结合经典生物学方法，能为澄清和解决红枣一些分类差异和遗传背景问题提供分子依据。殷晓等[32]利用SSR技术分析了陕北54 份枣种质的遗传结构。结果表明，陕北枣属于中度杂合，遗传多样性丰富，供试品种交流频繁，遗传多样性与品种有密切的关系。该课题组于2013年继续对陕西黄河沿岸的酸枣进行分析，结果表明，酸枣的群内变异远大于群体间变异，群体间基因流指数较高。得到黄河沿岸酸枣遗传多样性丰富，变异程度较高的结论，为酸枣种质保存提供了依据[33]。刁毅等[34]利用RAPD技术对安国枣、龙枣、沾化冬枣、野枣、胎里红、灰枣、酸枣等11 类枣进行品种遗传关系测定，利用12 个引物扩增条带后聚类分析结果得到，亲缘关系远近顺序为野枣＞台湾青枣＞龙枣及其他品种。

2.4 物种鉴定及育种

分子标记技术可以快速地鉴别新物种的来源、同一物种在不同地区品质的变化原因及找到新品种中优良基因，为下一步育种提供分子基础。孙学超等[35]根据SSR 带型的差异，分析了不同杂交组合时雄性不育种质育性，说明分子标记技术可以快速鉴定杂种。孟晓烨等[36]对来源于山东省乐陵市的30 个枣品种进行遗传图谱构建和聚类分析，从64 对引物中筛选出8 对引物，扩增出1 178个条带，多态性比率为97.48%，聚类分析后得到平均值为0.566 3，说明了新品种与原有品种的遗传差别，为进一步研究枣的成熟及抗裂果基因奠定了基础。上述试验表明分子标记技术可以分析枣间遗传多样性、快速找到新品种的优良基因，为育种提供强有力的理论依据。

分子标记不仅可以快速鉴别新物种，而且还可以对已有枣属进行物种鉴定。李继东等[37]应用ISSR 技术对河南栽培的9 个品种进行了分析，得出枣种之间存在着较高的遗传多样性，说明分子标记技术可以有效对不同品种进行物种鉴定。刘冬芝等[38]运用RAPD 技术分析了新品种高经济作物大酸枣的起源和种质资源，试验应用了16 对引物，为材料选取了三个类群的枣共11 种为材料，包括酸枣群、大酸枣和无核小枣等，选取的16 条引物清晰地将其分开，聚类分析后表明无核小枣与酸枣亲缘关系近；大酸枣是无核小枣与酸枣的一种中间类型。叶春秀等[39]对新疆地区特有新品种哈密玉枣进行了RAPD 分析，结果表明，运用2 条引物就可以将哈密玉枣进行聚类分析，可见分子标记技术通过聚类分析可以将枣进行物种鉴定。

3 小结

综上所述，分子标记在枣的遗传图谱构建、分类及亲缘关系、遗传多样性及鉴定育种方面还未得到广泛的应用。分子标记技术对于枣品种鉴定、种质资源保护、亲缘关系研究等都有十分重要的意义，弥补了传统分类及育种方法的不足。我国枣分子标记下一步的研究热点主要集中在以下四个方面：一是，对枣分子标记反应体系不断优化，高效地完成分子标记；二是，多种分子标记联用，弥补单一使用的缺陷；三是，不断改进现有的分子标记方式，使枣的分子标记技术更加简便、成熟；四是，采用传统与分子标记结合的育种方式。相信未来随着分子标记技术在红枣遗传育种研究上的深度扩展，可以有效缩短育种年限、提高育种效率，推动红枣遗传育种的研究，从而促进枣产业的发展。