我国猪瘟疫苗研究与应用进展

李 娇，祖立闯，王文秀，谢金文，沈志强，

（1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起猪的一种高度接触性、致死性的传染病，长期以来我国通过采取以疫苗免疫接种为主，结合抗体监测、生物安全等综合性防控措施有效防止了猪瘟的大规模暴发和流行[1-2]。随着全球范围内猪瘟净化工作的不断开展，部分欧洲和美洲国家已经彻底消灭了猪瘟，这对我国净化猪瘟具有重要的借鉴和指导意义。目前，我国商品化的猪瘟疫苗主要是基于中国猪瘟兔化弱毒株（C株）的系列弱毒疫苗，但该类疫苗均无法区分自然感染猪和疫苗接种猪，这种技术上的不足在很大程度上限制了我国猪瘟净化工作的开展，已经无法满足我国猪瘟净化的需要[3]。研制新型、安全、高效和能够区分疫苗免疫接种动物和野毒感染动物的新型标记疫苗逐步成为猪瘟防控领域的研究重点，且我国研究学者在猪瘟新型标记疫苗研究领域已经取得了一些重要进展。本文综述了我国猪瘟灭活疫苗、弱毒疫苗等常规商品化疫苗的应用现状以及亚单位疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗、合成肽疫苗、全长感染性cDNA标记疫苗等新型疫苗方面的研究进展，为新形势下进一步开展猪瘟疫苗的研发提供借鉴与参考，对我国猪瘟的综合防控具有一定的参考价值。

1 商品化疫苗

1.1 传统灭活疫苗

自猪瘟病毒流行以来，人们就一直尝试采用各种免疫方法对其进行预防和控制。最开始使用高免血清来免疫猪群，但存在高免血清获得困难并且存在较大散毒风险等缺点。随后，研究学者陆续开展灭活疫苗研究，其中以结晶紫灭活疫苗的推广应用最为广泛，在当时历史条件下为全球范围内猪瘟的防控做出了不可估量的贡献。灭活疫苗虽然安全，但利用组织培养的病毒效价较低，疫苗保护力不足，防治效果有限，限制了该类疫苗的发展。随着现代生物技术和生物制品产业的快速发展，这些初级猪瘟疫苗现已退出了市场。

1.2 弱毒疫苗

我国研究学者在20世纪50年代将猪瘟强毒在兔体内进行连续传代后获得猪瘟病毒兔化弱毒疫苗（HCLV）又称“C株”，该弱毒疫苗株具有安全、免疫保护力好、能够针对不同的猪瘟野毒株产生免疫保护力、遗传特性十分稳定等优点，于1956年开始推广使用，对世界范围内预防和控制猪瘟流行发挥了重要作用。弱毒疫苗可同时诱导较强的细胞免疫反应和体液免疫反应，产生良好的免疫保护效果，与灭活疫苗相比具有使用剂量小、免疫原性好、不需佐剂、产生免疫快、抗体持久、成本低、使用方便等优点。目前我国使用的商品化弱毒疫苗有兔源脾淋源猪瘟活疫苗、细胞源猪瘟活疫苗、传代细胞源猪瘟活疫苗、猪瘟-猪丹毒-猪多杀性巴氏杆菌病三联活疫苗、猪瘟-高致病性猪繁殖与呼吸综合征二联活疫苗。

1.2.1 兔源脾淋源猪瘟活疫苗 该类疫苗是通过将猪瘟兔化弱毒株接种成年家兔，挑选感染定型热的家兔，经无菌采集其脾脏和淋巴结进行碾磨、冷冻干燥制备而成，其优点是免疫原性强，接种后免疫效果好，抗体产生速度快，持续时间较长，同时该疫苗中含有某些免疫相关因子，能起免疫增强剂的作用。其缺点是在生产过程中需要活体动物，疫苗生产的成本较高，也不符合动物福利。目前市场上所使用的该类疫苗有猪瘟活疫苗（兔源）、政府采购专用猪瘟活疫苗（脾淋源）、猪瘟耐热保护剂活疫苗（兔源）。其中耐热保护剂类疫苗解决了常规弱毒疫苗对保存和运输条件要求高，不利于长途运输等缺点，该疫苗可以长时间在4℃的环境中保存和运输，极大地方便了疫苗产品的推广与应用，降低了产品质量因保存条件不佳而失效的几率，从而保障产品质量更加稳定。

1.2.2 细胞源猪瘟活疫苗 该类疫苗是通过将猪瘟兔化弱毒株接种于犊牛睾丸细胞中进行培养，收获细胞培养物，冷冻干燥后制成，目前市场上所使用的该类疫苗有猪瘟活疫苗（细胞源）、政府采购专用猪瘟活疫苗（细胞源）、猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源）。该类疫苗具有生产成本低、生产量大，生产过程容易监控等优点，但该类疫苗生产时需要使用异源原代细胞培养，产品批间差异较大，且存在牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染的威胁。

1.2.3 传代细胞源猪瘟活疫苗 该类疫苗是通过将猪瘟弱毒株接种于猪睾丸传代细胞（ST细胞）中进行培养，将细胞培养物冷冻干燥而成，目前市场上所使用的该类疫苗有猪瘟活疫苗（传代细胞源）。该类疫苗是使用ST传代细胞系进行培养，在生产过程中其批量间差异较小，稳定性较好，可以连续大批量生产，生产过程容易监控，且避免了BVDV的干扰，更重要的是该类疫苗能保证接种猪只在母源抗体的干扰下仍能获得较理想的抗体水平，是目前猪瘟弱毒疫苗中最先进、使用最广泛的疫苗。

1.2.4 猪瘟-猪丹毒-猪多杀性巴氏杆菌病三联活疫苗 该类疫苗是通过将猪瘟兔化弱毒株接种乳兔或易感细胞，收获含毒乳兔组织或细胞培养病毒液，以适当比例和猪丹毒杆菌弱毒菌液、猪源多杀性巴氏杆菌弱毒菌液混合，经冷冻干燥制成，可同时用于预防猪瘟、猪丹毒、猪多杀性巴氏杆菌病。由于一般猪瘟疫苗在生产过程中含有双抗，而双抗对猪丹毒杆菌和猪肺疫杆菌具有明显的抑制作用，因此配置三联苗必须应用不含双抗的猪瘟乳兔组织或细胞培养物，对猪瘟疫苗的生产工艺提出了更高要求。

1.2.5 猪瘟-高致病性猪繁殖与呼吸综合征二联活疫苗 目前我国市场上商品化的该类疫苗只有高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟二联活疫苗（TJMF92株+C株），该疫苗是通过将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92弱毒株与猪瘟病毒兔化弱毒C株分别接种Marc145细胞和牛睾丸（BT）传代细胞培养，收获细胞培养物后按适当比例混合，加耐热保护剂，经冷冻真空干燥制成。该疫苗使用耐热保护剂，可在2～8℃保存18个月，“两病同防”，一针解决猪瘟、高致病性猪繁殖与呼吸综合征两大猪病，简化免疫程序，减少对仔猪的应激，降低人力成本。同时，该二联疫苗在猪瘟疫苗效力检验方面，采用免疫荧光定量技术（FAID50）替代了传统猪瘟弱毒疫苗一直沿用的兔定型热效力检验方法（该效检方法是通过兔子体温变化间接定量猪瘟疫苗病毒含量的方法，由于我国并没有检验用兔标准，导致各批次疫苗的批间抗原量差异大，免疫效果也极不稳定）。FAID50应用免疫荧光方法对病毒半数组织感染量进行测定，即把猪瘟疫苗按不同的稀释度接种到传代细胞上增殖，通过荧光色素标记抗体与细胞表面及细胞浆内的猪瘟抗原结合后，置荧光显微镜下观察，细胞浆中出现特异性荧光即判断有一定量的病毒复制，实现了在细胞水平对猪瘟病毒进行更准确的定量，为保持产品稳定、减少产品批间差提供了保障。

1.3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是将病原体保护性抗原基因导入到受体细胞或细菌中，使抗原蛋白获得高效表达，并将表达的蛋白与佐剂联合制成的疫苗。亚单位疫苗与常规灭活疫苗相比，安全性更好，但免疫原性略差，需要和佐剂同时使用才能达到免疫效果。由于猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，使E2蛋白成为是猪瘟亚单位疫苗研究的首选蛋白。目前我国市场上商品化的该类疫苗只有猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗（Rb-03株），该疫苗是将猪瘟病毒E2蛋白重组于杆状病毒内，在昆虫细胞上培养表达猪瘟病毒E2蛋白而制成的新型基因工程疫苗。由于该疫苗不是全病毒疫苗，而是一种仅含有猪瘟E2抗原蛋白的标记疫苗，不存在全病毒弱毒疫苗基因突变或毒力返强的危险，具有良好的安全性，同时该疫苗只诱导猪体产生E2蛋白抗体，因此可以通过对E2蛋白和非E2蛋白的抗体检测来区分猪只是感染了野毒还是免疫了疫苗，弥补了猪瘟兔化弱毒疫苗不能区分野毒感染与疫苗免疫动物的缺陷，为我国猪瘟的净化提供了技术支持，将有力推动我国猪瘟防控从预防控制向免疫净化阶段的迈进。

2 新型疫苗研究

2.1 核酸疫苗

核酸疫苗又称DNA疫苗或基因疫苗，是将含有病原体结构蛋白的真核表达载体作为疫苗直接进行免疫，使机体产生特异性免疫应答的一类基因疫苗，其能够同时诱导细胞免疫和体液免疫，可产生持久性的免疫应答反应，具有易于生产、方便保存运输、可诱导机体长期或终身免疫、可制备针对多种病原体的多价疫苗等优点。郭抗抗等[4]将猪瘟病毒E2基因定向克隆至表达载体pSCA1中，构建DNA疫苗重组质粒pSCA1-E2，将纯化的pSCA1-E2质粒分别免疫小鼠和试验猪，二免后分别检测小鼠脾淋巴细胞刺激指数和猪血清抗猪瘟特异性抗体水平，免疫小鼠产生较高水平的淋巴细胞刺激指数，免疫猪可检测到抗猪瘟特异性血清抗体，为进一步研制新型猪瘟核酸疫苗提供了基础材料。

2.2 活载体重组疫苗

重组活载体疫苗是将病原体的保护性抗原基因与其他具有复制功能的其他载体病毒进行重组，该类重组疫苗可通过多种途径进行免疫，可以诱导动物机体产生体液免疫和细胞免疫，目前猪瘟E2蛋白基因已经在痘病毒、腺病毒、伪狂犬病病毒等不同的病毒载体中获得表达，在临床试验中显示出巨大的潜在应用价值。

2.2.1 痘病毒活载体疫苗 痘病毒以其宿主特异性、外源基因容量大、在哺乳动物中发生顿挫感染等特性成为构建动物病毒活载体疫苗的首选载体之一，李谱华等[5]将猪瘟病毒E2蛋白基因片段定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上，将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞后筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E2，将该重组鸡痘病毒3次腹腔接种小鼠，ELISA检测血清中猪瘟病毒抗体滴度为1∶4 096，将该重组鸡痘病毒颈部和腹股沟皮下分点注射免疫猪3次，4周后用猪瘟病毒石门强毒株以100 LD50接毒量攻击，保护率达75%，为猪瘟重组鸡痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。

2.2.2 腺病毒活载体疫苗 腺病毒具有基因转移效率高、毒力低、宿主范围广、外源基因装载容量大等优点，能够在体内表达天然的、保持完整生物活性的抗原蛋白并诱导特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，是一种良好的活病毒载体。杨玉艾等[6]将猪瘟病毒E0和E2基因定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2，将其转染人胚胎肾细胞成功包装出重组腺病毒rAd-E0-E2，将rAd-E0-E2经肌肉2次免疫接种6～7周龄猪，3周后用103TCID50的猪瘟野毒株（石门株）攻击，rAd-E0-E2免疫组猪存活率达85.71%，而非重组E0-E2基因的腺病毒免疫组和空白对照组全部死亡，表明rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗猪瘟强毒攻击，为猪瘟腺病毒重组活载体疫苗的研究开发奠定了基础。

2.2.3 伪狂犬病病毒活载体疫苗 伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起猪的以仔猪的高死亡率、母猪的繁殖障碍、公猪种用性能降低或丧失、肥猪的神经及呼吸系统症状为主要特征的急性传染病，PRV基因组编码70～100种蛋白，其中含有大量与病毒增殖无关的非必需区可供外源基因的插入，是优良的活病毒载体。韩爽等[7]以 TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的PRV-BE为亲本株，通过同源重组构建了表达猪瘟病毒主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病病毒PRV-CSFV PE2SC，对重组病毒在PK15细胞中的遗传稳定性、增殖特性等进行的研究表明重组病毒在体外连续传20代后仍能稳定遗传，具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，该活载体疫苗可同时预防猪瘟和伪狂犬病两种主要传染病，为猪瘟和猪伪狂犬病根除计划的实施提供了技术保障。

2.3 合成肽疫苗

合成肽疫苗是指根据病原体基因组核苷酸序列推导出其蛋白质的氨基酸序列，通过人工合成的方式制备相应的氨基酸寡肽，偶联佐剂制成疫苗。Zhou等[8]合成了猪瘟E2蛋白的两个B细胞线性表位RE2-A和RE2-B，获得了猪瘟多表位疫苗，将该疫苗两次免疫动物后可产生中和抗体。Tian等[9]构建了串联多个猪瘟E2抗原表位的多肽疫苗，攻毒试验显示多肽疫苗可保护免疫猪抵抗猪瘟病毒野毒株的攻击。合成肽疫苗能根据病毒变异情况快速开发出有效的针对性疫苗，具有极高的开发前景，但合成肽疫苗由人工合成制得，单一的线性抗原表位对病毒的保护力有限，多个中和表位串联和添加合适的佐剂是目前增强合成肽疫苗免疫原性的有效手段，而对猪瘟病毒抗原表位和空间构像的深入研究是开发合成肽疫苗的关键。

2.4 全长感染性cDNA标记疫苗

全长感染性cDNA标记疫苗是利用反向遗传学技术将具有标记性的基因替换或克隆到致弱病毒全长cDNA中获得重组病毒，是利用标记基因区分疫苗株和野毒株的一类疫苗。随着反向遗传学技术的快速发展和在动物病毒学领域的应用，猪瘟全长感染性cDNA标记疫苗得到了研究学者的广泛关注，其将标记性基因克隆到猪瘟病毒弱毒cDNA中，从而使疫苗具有区分野毒感染和疫苗免疫的优势，是亟需大力发展的一种新型猪瘟疫苗。邹兴启等[10]以猪瘟病毒C株为研究材料，经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段，用合适的酶切位点连接，成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS，体外转录得到RNA，然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞，通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测表明成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆，为新型猪瘟cDNA标记疫苗的研发提供了试验依据。

3 小结与展望

自2007年起，我国采取了以强制免疫为主的猪瘟综合防控策略，在实施了近10年的强制免疫政策后，2017年国家取消了猪瘟强制免疫政策，改为对符合条件的养殖场实行“先打后补”的财政补助政策，表明我国猪瘟防控工作取得了阶段性成果，猪瘟防控进入了新的历史阶段，距离实现猪瘟防控的终极目标（净化）已经不远。无需置疑的是，传统疫苗在我国防控猪瘟中发挥了不可替代的巨大作用，但其无法区分野毒感染和疫苗免疫动物的缺陷已经不能完全满足以后国家猪瘟净化工作的需要。与传统疫苗相比，新型疫苗能够区分野毒感染和疫苗免疫，且具有廉价、安全、高效、易于运输与保存等优点，其在猪瘟防控中将发挥越来越重要的作用，实现理想的免疫效果，但当前我国在新型疫苗中只有亚单位疫苗实现了商品化，其它的新型疫苗尚处于研究阶段，相信随着基因工程技术的不断发展以及猪瘟免疫机制研究的不断深入，猪瘟的各类新型疫苗将会逐步得到完善，为我国猪瘟的综合防控和净化提供技术保障。