荆条蜜中特征性成分鉴定

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、植物活体分泌物或昆虫排泄物，带回巢房中贮存，并加入自身特殊的分泌物，进行转化、脱水至成熟的天然甜物质[1]，是人类早期非常重要的能量来源之一。荆条蜜作为我国四大名蜜之一，在我国被列为一等蜜，产量大而且稳定，是每年稳定收入的蜂蜜品种。荆条蜜也叫荆花蜜，其蜜源植物为落叶灌木荆条（也叫荆子），该植物耐贫瘠，耐旱且花期较长，主要分布于我国华北和东北南部地区。荆条蜜呈浅琥珀色，易结晶，结晶后呈细腻白色，气味清香，口感甜润[2]。

蜂蜜作为天然保健品，富含有机酸、矿物质、维生素、酚类等天然活性物质，国内外多项研究表明，蜂蜜具有调节胃肠道、抗氧化、促进伤口愈合、调节血糖平衡、抗炎等多种功能活性[3-5]。其中多酚类物质作为蜂蜜中一类非常重要的化合物，与蜂蜜的大多数功能活性有关[6-8]。研究表明荆条蜜中的多酚类物质具有延缓果蝇衰老[9]、保护DNA损伤[10]的功效，应用价值显著。

本研究通过对荆条蜜中多酚类成分进行定量分析，找出荆条蜜中特征性成分并对其结构进行鉴定，建立荆条蜜的标准指纹图谱，为日后商品蜜的真实性评价提供参考指标。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

荆条蜜于2018年采自山西省沁水县。主要试剂包括：标品新绿原酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、p-香豆酸、反，反式脱落酸、顺，反式脱落酸、短叶松素；分析纯甲醇、甲酸、氨水购自北京索莱宝科技有限公司；色谱级甲醇、乙酸，质谱级乙酸购自美国Fisher公司；DMSO-d6购自Adamas公司；实验用水为超纯水。

1.2 实验仪器

Sorvall ST8 ST8R型台式离心机（美国Thermo Fisher公司）；Strata-X-A固相萃取柱（60mg/3ml）（美国Phenomenex公司）；无菌注射器（江苏正康医疗器械有限公司）；24孔固相萃取装置（美国Supelco公司）；0.22μm微孔滤膜（Milipore公司）；移液器（美国Thermo公司）；JC-QXS-4.5L型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；超纯水系统（Merk Millipore公司）；LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；氮吹仪（冠森生物科技上海公司）；AD-9925型真空泵（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；高效液相色谱仪和6520四级杆-飞行时间质谱（Q-TOF）（美国Agilent公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 蜂蜜中多酚类化合物的富集

（1）蜂蜜样品的前处理：准确称量蜂蜜样品20g，用80ml超纯水充分溶解，使用氨水调节pH =7。

（2）离心去除杂质：蜂蜜溶液在9000×g离心15min除去蜂蜜水中的固体不溶物，取离心后的上清液倒入烧杯备用。

（3）固相萃取柱的活化和平衡：用3ml分析级甲醇对固相萃取柱进行活化，再用5ml水（pH=7）对固相萃取柱进行平衡。

（4）富集蜂蜜溶液中的多酚类化合物，将蜂蜜上清液依次通过平衡后的固相萃取柱。

（5）多酚类化合物的收集：蜂蜜溶液过完萃取柱后，用4ml超纯水清洗萃取柱，再用3ml甲醇（含10%甲酸）溶液进行洗脱，收集洗脱液。

（6）洗脱液用氮气（氮吹仪）吹至干燥，随后用2ml甲醇（色谱级）进行复溶，再过0.22μm 微孔滤膜于液相上样瓶中备用。

1.3.2 蜂蜜样品的高效液相色谱分析条件

色谱柱：Shim-Pack PREP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；样品进样量为20μl，检测波长为254nm；柱温箱温度为38℃。流动相A：水（含0.1%的甲酸），流动相B：甲醇（含0.1%的甲酸），总流速0.7ml/min。

高效液相梯度洗脱程序：0～10min，9%～15%B；10～17min，15% B；17～28min，15%～17% B；28～38min，17%～25% B；38～45min，25%～32% B；45～55min，32%～33% B；55～65min，33%～34%B；65～70min，34%～36% B；70～75min，36% B；75～85min，36%～40% B；85～90min，40%～45% B；90～95min，45%～53% B；95～120min，53%～64% B；120～135min，64%～80% B。

1.3.3 质谱分析条件

液相质谱（LC-QTOF）分析条件：离子源为ESI源（电喷雾），离子源喷射电压为4kV，出口电压为130V，加热的温度350℃，氮气（N2）流速为11 l/min，碰撞气体为氦气，雾化气流速为80kPa，雾化器的压力40psi，质量扫描范围m/z=60～900Da。

2 结果分析

2.1 荆条蜜中特征性成分鉴定

荆条蜜中已经鉴定出11种多酚类成分其中包括：新绿原酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、短叶松素、反，反脱落酸、松属素、p-香豆酸、顺，反-脱落酸、山奈酚和柯因。但其中较明显的成分化合物6（图1）未确定其结构，从荆条蜜的HPLC色谱图中可以看到，化合物6是荆条蜜的特征性成分，因此我们将它命名为荆条素（Vitexin）并通过LC-MS对其化学结构进行了鉴定。

图1 荆条蜜样品中多酚类化合物的HPLC图谱

图2为荆条蜜在ESI源下的正、负离子模式的一级质谱图，从中可以看到正离子模式下651.1914m/z [M+Na]+的分子离子峰；在负离子模式下可以看到明显的627.1879m/z [M-H]-分子离子峰，负离子模式下，表现为产生[M-H]-的准分子离子峰并且这显著是多酚类化合物的电离特征，在二级质谱图（图3）上主要表现为脱去两分子六碳糖的质谱裂解特征。以脱氧葡萄糖（C6H10O5）的形式脱掉糖苷分别产生离子m/z 465、m/z 303，其中m/z 303、m/z 285表示化合物明显脱水。结合脱水和脱糖苷的过程，分析化合物的分子式为C27H32O17。以M 286为母核的多酚类天然产物主要有以下几种，结合以上由m/z 303-＞m/z 285的脱水特征裂解途径，m/z 285-＞m/z 241为脱CO2的裂解途径，可以判断只有产生类木犀草素的离子符合。在负离子模式下作多级裂解分析，可以发现当碰撞能量提高，碎片离子m/z 285和m/z 303的强度未有显著改变，分析可能是由于该离子较为稳定，不易碎裂，所以推测其前体离子是m/z 303或为Taxifolin负离子。通过结合Chemspider和Scifinder对分子式为C27H32O17并含有两个糖苷元的化合物的检索，只有3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷（图4）符合。

图2 正、负离子模式下化合物11的质谱图

图3 负离子模式下化合物6的二级质谱图（LC-QTOFMSMS）

图4 3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷

该化合物在正、负离子模式下的质谱裂解途径如图5、图6所示（低质量端主要为糖苷裂解产生），结果表明化产物中的碎片离子的归属得到了合理的解释。

图5 3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷负离子模式下质谱裂解途径（ESI-）

图6 3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷正离子模式下质谱裂解途径（ESI+）

表1 原料荆条蜜样品中多酚类化合物含量 (μg/100g)

综上，通过质谱分析，我们确定了荆条蜜中标志性成分—荆条素，其化学命名为：3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷，英文名为：7-O-β-Dglucopyranosyl-dihydroquercetin-3-O-α-Dglucopyranoside。

2.2 荆条蜜中多酚类成分HPLC-PDA定量

15个荆条原料蜜样品中的多酚类成分采用HPLCPDA外标法定量，结果如表1所示。

对不同产地收集的15个荆条原料蜜中9种多酚类成分进行定量分析，15个样品中各成分含量存在差异。所有样品中荆条素的含量最高，含量范围为668.48μg/100g～8600.10μg/100g，平均含量为2500.11μg/100g，中位数为1347.08μg/100g；除样品V7、V8和V13外，其他样品中荆条素的含量均大于1000μg/100g。

2.3 荆条蜜多酚类成分指纹图谱的建立

将不同产地收集的15个原料荆条蜜的高效液相色谱图导入到中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行 分析。对15个样品的色谱峰进行匹配和多点矫正，并生成整合的HPLC图谱（图8）。选择具有代表性的4个峰，模拟生成具有代表意义的荆条蜜标准指纹图谱（图7），计算15个原料蜜样品的相似度。

15个样品之间相似度较一致，计算相似度范围在0.72～0.93之间，其中样品V1、V2、V5、V9、V10和V12相似度高于0.9，表明这几个样品与对照图谱较一致；V3、V4、V6、V11和V14样品的相似度小于0.8，表明其相似度较低；但整体上样品的相似度都在0.8左右，因此这15个原料荆条蜜整体较一致。

图7 荆条蜜标准指纹图谱 （1～4号分别为4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸和荆条素）

图8 原料荆条蜜样品生成的HPLC色谱图

3 结论

多酚类化合物广泛存在于植物的根、茎、叶中，与植物的生理功能有重要联系[11-13]。多酚类物质主要包括酚酸和黄酮两大类，植物细胞中的黄酮类化合物常与糖结合形成苷，以苷类形式存在。蜂蜜中的黄酮类化合物主要来自于蜜源植物，因此多以糖苷形式存在[14]。研究表明，有些多酚类成分可以作为单花蜂蜜的标志性成分，如：向日葵蜂蜜中的槲皮素、麦卢卡蜂蜜中的没食子酸、油菜蜜中的绿原酸和鞣花酸等[15]。因此，蜂蜜中多酚类化合物广泛应用于单花蜜溯源和真实性评价。

本研究通过对荆条蜜的多酚类成分进行分析，首次鉴定出3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷，并将其命名为荆条素（Vitexin）。多项研究表明花旗松素-3-O-葡糖苷以及与荆条素有类似结构的黄酮苷类化合物如落新妇苷等，有重要的生物活性功能[16-18]，如抗氧化、抗菌、调节免疫力、抑制肿瘤等作用。在收集的所有原料荆条蜜样品中均含有以下四种成分，分别为4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸和荆条素，其中荆条素的含量最高，目前荆条素只在荆条蜜中发现，故将其作为荆条蜜的特征性成分。通过建立的指纹图谱发现，荆条蜜样品之间有较好的相似度。

蜂蜜备受消费者的青睐，但是目前质量参差不齐，蜂蜜市场乱象丛生，有大量的掺假蜂蜜流向市场，根据建立的标准指纹图谱，可以比对出掺假蜂蜜，甚至可以选择出优质蜂蜜。本研究对荆条蜜的特征性成分定性、定量以及建立的指纹图谱，可为开发蜂蜜功能活性、蜂蜜溯源及商品蜜的真假鉴别提供参考。