不同浓度氯化钾对小鼠海马神经元膜电位的影响

刘爱丽，谌 辉

（天津医科大学 生物医学工程与技术学院，天津 300070）

由于细胞膜两侧离子的不均匀分布，导致膜两侧存在一定的电位差， 称为膜电位（ membrane potential）[1]。细胞未接收刺激时处于非兴奋状态下的膜电位为静息膜电位（resting membrane potential，RMP）[1-2]。静息膜电位对细胞维持良好的功能状态起关键调控作用，如细胞增殖、分化、迁移以及发育和再生过程中的形态形成等，具有重要生物学意义[3-7]。当膜电位比静息膜电位变得更正时，细胞发生去极化；如果变得更负，则称为超级化[8]。有研究发现膜电位与多种病理生理状态（肿瘤、发育障碍等）有密切关系[4,9]。因此，对细胞膜电位的研究至关重要。本文利用膜片钳技术，记录4 种氯化钾浓度下小鼠海马神经元膜电位的变化以及动作电位特性的改变。研究不同浓度氯化钾对神经元膜电位和动作电位的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～6 周龄SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠，购于北京军事医学科学院实验动物中心。小鼠在12 h/12 h 昼/夜循环的室温（21～24 ℃）环境下分笼饲养，自由饮食取水。实验过程中对动物的处理均符合动物伦理学标准。

1.2 溶液配置

（1）人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF，mmol/L）：2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgSO4、120 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、26 mmol/L NaHCO3、10 mmol/L Glucose，pH=7.4～7.6，用HCl 和NaOH 调节pH 值。

（2）电极内液（mmol/L）：150 mmol/L Kalium-D-gluconat、10 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、0.25 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgATP，pH=7.2，用KOH调节pH 值。

（3）氯化钾溶液：1 mol/L。

以上试剂中Kalium-D-gluconat、HEPES、EGTA、MgATP 购于Sigma 公司，其他均为国产分析纯。

1.3 小鼠海马脑片的制备

将小鼠快速断头取脑，置于充满混合氧（95% O2+5% CO2）的0～4 ℃人工脑脊液中冷冻1～2 min，取出放置于冷冻手术台上进行修块，然后用胶水将脑组织固定于全自动震荡切片机（VT1200S，Leica）上，切成350 μm 厚度的脑片。将脑片转移到32 ℃人工脑脊液中孵育1 h 后于室温条件下继续孵育，整个孵育过程中持续通混合氧（95% O2+5% CO2）。孵育完成后，将脑片置于记录浴槽中，在正置显微镜（BX51WI，Olympus）下挑选表面光滑、轮廓清晰的海马CA1 锥体神经元进行全细胞膜片钳记录[10]。

1.4 全细胞膜片钳记录

实验中所用电极由水平拉制仪（Sutter P-97）拉制， 入液电阻为 3～5 MΩ 。 利用膜片钳放大器（MuitiClamp700B）和数模转换器（Digidata 1440）采集记录信号，并在Clampex 10.7 软件上设置相应的Protocol 并采集数据，采样频率为10 kHz，低通滤波为2 kHz。神经元与电极形成高阻（＞2 GΩ）封接之后，给予负压破膜形成全细胞模式，将串联电阻和膜电容补偿到60%～80%，利用P/4 漏减刺激脉冲进行实时漏减。补偿后将电压钳模式转换成电流钳模式，记录神经元膜电位。整个记录过程在室温（21～25 ℃）下进行。

1.5 数据处理与分析

所得实验数据均利用软件pCLAMP Clampfit 10.7和Graphpad Prism 6.02 处理实验数据，采用t-test 进行统计学分析并作图，数据结果用Mean±SEM 来表示。统计学水平为0.05（*P＜0.05，**P＜0.01 有显著统计学差异）。

2 实验结果与分析

2.1 氯化钾对海马神经元膜电位的影响

电流钳模式下记录小鼠海马CA1 锥体神经元静息膜电位，待记录基线稳定后，依次加入1 mol/L 氯化钾溶液将记录浴液中的 K+浓度增加到 5、7.5、10 mmol/L，并持续记录膜电位的变化。如图1 所示，神经元静息膜电位为-64.42±0.36 mV（N=10）。同时，实验发现氯化钾会刺激神经元，使膜电位发生去极化。随着氯化钾浓度的升高，膜电位持续去极化，分别为：-58.5±0.33 mV（N=8），-51.79±0.45 mV（N=10），-44.00± 0.65 mV（N=10）。

图1 不同浓度氯化钾对海马神经元膜电位的影响

2.2 氯化钾对海马神经元动作电位的影响

氯化钾刺激神经元发生膜去极化，使细胞产生兴奋性。实验发现当记录浴液中K+浓度增加至7.5 mmol/L时，膜电位会达到阈电位从而诱发产生动作电位（action potential，AP），如图2 所示。图2(a)为7.5 mmol/L KCl组和10 mmol/L KCl 组的动作电位发放曲线图，相同时长内10 mmol/L 组诱发动作电位的数量较7.5 mmol/L多。图2(b)为单个动作电位的波形图。7.5 和10 mmol/L KCl 诱发动作电位的发放频率（frequence of AP，Hz）分别为1.556±0.438 3 Hz（N=8）、3.474±0.4931 Hz（N=8），具有统计学差异（P＜0.05，见图2(c)）。与7.5 mmol/L KCl 相比，10 mmol/L KCl 引起膜电位去极化，海马神经元兴奋性升高。

图2 不同浓度氯化钾对海马神经元动作电位发放频率的影响

随后，利用pCLAMP Clampfit 10.7 提取数据，对7.5 和10 mmol/L KCl 诱发动作电位的一些特性进行分析，包括幅值（amplitude of AP）、到达顶峰时长（time to peak amplitude）、最大上升斜率（max rise slope）以及最大下降斜率（max decay slope）等，并作统计学比较（见表1）。如图3 所示，KCl 浓度分别增加至7.5 和10 mmol/L 时，动作电位的幅值和最大上升斜率均具有显著性差异（P＜0.01），最大下降斜率也有明显差异（P＜0.05），而到达顶峰时长没有统计学差异。实验发现7.5、10 mmol/L KCl 对动作电位的特性有明显影响。

表1 不同浓度氯化钾诱发动作电位特性的数值

图3 不同浓度氯化钾对动作电位特性的影响

3 结语

海马神经元为可兴奋性细胞，接受化学刺激或电刺激后膜电位会发生改变。当受到强烈刺激时，膜电位会达到阈电位从而产生动作电位。动作电位是维持神经元兴奋性功能的基础[11-12]。实验结果表明，氯化钾会使神经元膜电位发生去极化，神经元兴奋性增强。并且随着浓度的增加，膜电位持续去极化。7.5 mmol/L KCl 可诱发神经元产生动作电位，10 mmol/L KCl 诱发动作电位的频率增加，兴奋性增强。与7.5 mmol/L KCl比较，10 mmol/L KCl 诱发动作电位的幅值明显减小，最大上升斜率显著降低，最大下降斜率升高，而到达顶峰时长没有明显变化。实验研究发现，高浓度氯化钾可诱发神经元产生动作电位，且动作电位的频率、幅值、上升斜率和下降斜率受氯化钾浓度影响。