头颈部鳞状细胞癌相关DNA甲基化的研究进展

方 一（综述） 陈 健 吴海涛（审校）

（复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科 上海 200031）

头颈部恶性肿瘤的发病率在所有恶性肿瘤中排第6位，其中以头颈部鳞状细胞癌（简称头颈鳞癌）为主，2012年全球范围内共造成约78万人死亡，占癌症总死亡率的10%［1］。随着临床医学的发展和检测技术的进步，早期诊断的头颈鳞癌患者生存率可高达75%～80%，但大部分患者直到晚期才被确诊，远期生存率仅为35%［2］。早期诊断成为提高头颈鳞癌患者生存率的关键之一。癌前病变是指特定器官存在的良性病变，易出现细胞异常增生，具有恶变倾向，对于监测恶性肿瘤的发生具有重要的意义［3］。DNA甲基化是一种针对DNA 5'端核苷酸胞嘧啶的共价修饰，可以在不改变基因序列的前提下调节DNA的转录活性等，并保护DNA位点不被特定限制酶降解，是目前已知表观遗传学中DNA修饰的唯一方式［4］。已有大量研究证明DNA甲基化与肿瘤有关，且多发生在肿瘤生成的早期阶段，并参与恶性肿瘤的进展和转移［5-6］，根据肿瘤甲基化数据库 PubMeth（www.pubmeth.org），常 见 的 与DNA甲基化有关的肿瘤是肺癌、胃癌、结直肠癌、白血病、脑瘤、肝癌、乳腺癌和前列腺癌，而其在头颈部肿瘤中的研究相对较少。因此，本文对DNA甲基化在头颈鳞癌中的作用进行综述。

DNA甲基化在肿瘤发生中的作用1950年Wyatt等［7］首次报道真核细胞中存在核酸甲基化的现象。1983年Feinberg等［8］系统总结了肿瘤细胞中DNA甲基化的情况，并使该领域得到重视。DNA甲基化通过共价化学修饰在5'端胞嘧啶添加甲基基团，通常导致基因位点的沉默。除少数位于5'-CA-3'和5'-CT-3'序列，甲基化最常发生在5'-CG-3'序列中（也被称为CpG二核苷酸）。人类基因组中大部分序列中存在DNA甲基化现象，约每100 kb会出现长度为0.5～5 kb的特殊区域，其中富含未甲基化的CG序列（60%～70%），被称为CpG岛。CpG岛存在于人类基因组大半的基因转录起始位点，即主要位于中高度转录活性或者保持静止的基因，如管家基因和组织特异性基因。因而基因组、尤其是CpG岛内的异常甲基化将会改变序列表达的起始位置，进而导致表型的改变。

肿瘤细胞中的异常DNA甲基化常出现在肿瘤发生的早期阶段，基因位点过甲基化和全基因组低甲基化的特点，其中对过甲基化的研究远多于后者。多项针对肿瘤过甲基化的研究证明其通常与抑癌基因的沉默有关，进而导致细胞周期、细胞凋亡或基因稳定性的改变。Flavahan等［9］发现，异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）的原发突变通过影响10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白，使得镉离子结合蛋白质CTCF结合位点出现过甲基化，进而激活成瘤基因血小板源性生长因子受体α多肽，促进胶质瘤的发生。另一项关于小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）的研究指出，RAS相关区域家族1A（RASSF1A）位点是防止细胞产生干细胞样增殖的“天然屏障”，而40%SCLC患者中存在RASSF1A位点内增强子的异常甲基化，导致该位点沉默，失去其肿瘤抑制作用［10］。

肿瘤全基因组的低甲基化状态同样在恶性肿瘤中普遍存在。目前认为低甲基化状态下成瘤基因更易被激活，从而促进肿瘤生成。Wu等［11］研究发现，全长配对盒基因2是调节子宫内膜细胞增殖和生长的关键性基因，其因在子宫内膜癌中的异常激活而被认为是成瘤基因，并与他莫昔芬的耐药有关，而该位点增强子的异常激活已被证实与肿瘤相关低甲基化有关。其次，低甲基化导致的活动性DNA信息载体异常与肿瘤相关。DNA甲基转移酶抑制子触发胞质内双链DNA（dsDNA）受体，从而促进异常细胞的凋亡，而敲除该受体则会促进卵巢癌、恶性黑色素瘤和其他肿瘤的进展［12］。动物实验提示DNA低甲基化引起的染色体不稳定性也是导致肿瘤发生的原因之一，这可能与逆转座子LINE-1的去甲基化有关［13］。

DNA甲基化与头颈部肿瘤相关易感因素的关系表观遗传信息受到基因组序列、环境暴露和随机因素的影响，其中环境因素暴露已成为研究热点。吸烟、长期酗酒、病毒感染是头颈部肿瘤共同的易感因素，会导致DNA甲基化改变，促进肿瘤发生。

吸烟主要通过以下4个方面影响DNA甲基化：（1）破坏DNA结构。烟草中含有近60种致癌物，其中氮杂芳烃、亚硝胺、氨基甲酸乙酯、环氧乙烷等可导致DNA双螺旋结构的破坏，在DNA的修复过程中招募的DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase，DNMT1）对临近 CpGs进行错误甲基化［14］；（2）尼古丁影响DNA甲基化水平。尼古丁激活cAMP相关信号通路的同时，也具有下调DNMT1表达水平的作用，从而改变基因组的甲基化［15］；（3）影响 DNA结合因子间接改变甲基化。吸烟可以上调细胞内刺激蛋白Sp1的表达，后者与富含CG的基因增强子模块结合，从而阻止CpG岛发生从头甲基化［16］；（4）局部组织缺氧激活甲基化。吸烟会导致组织微环境的缺氧状态，一方面激活HIF-1α依赖通路，促进合成甲基转移酶，另一方面抑制TET蛋白活性［17］，从而影响DNA甲基化水平。

酗酒对DNA甲基化的影响主要与S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAMe）及一碳单位代谢通路（one-carbon metabolism）有关。一碳单位代谢的实质是将SAMe上的甲基化基团通过一系列反应转移至DNA等其他化合物上，而酒精可以干扰其中多个酶的功能，从而导致DNA甲基化水平的改变。酒精可以抑制蛋氨酸腺苷转移酶（methionine adenosyl transferase，MAT），从而减少SAMe生成，同时可以抑制DNMT，致使SAMe上的甲基基团无法进入循环；5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶受到酒精抑制后，5-甲基四氢叶酸无法脱甲基为四氢叶酸，从而使碳单位循环受阻［18］。酗酒导致叶酸、维生素B12等营养物质吸收障碍［19］，一碳单位代谢受到抑制、DNA的不稳定性增加并导致异常的甲基化状态，从而促使肿瘤发生。

病毒感染在头颈部肿瘤发生发展中的作用日益受到重视，其中以人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和 EB 病 毒（Epstein-Barr virus，EBV）最为典型［20］。Zhao 等［21］报道头颈部肿瘤中作为甲基化“清除器”的TET甲基化系数与HPV感染状况存在相关性，研究认为EBV相关鼻咽癌患者中ITGA4、RERG和ZNF671基因的甲基化可以区分肿瘤与正常组织，其中的病毒作用机制仍未明确，病毒可能通过调节宿主细胞DNA甲基化来抵御抗病毒免疫，改变免疫微环境［22］。

与头颈鳞癌相关的DNA甲基化位点头颈鳞癌发病隐匿，常因不能早期诊断而延误治疗，基因甲基化为恶性肿瘤早期改变的特点之一，因此成为潜在的筛查生物标志。根据功能改变，基因位点可分为以下4类：（1）加快细胞周期促进增殖。RASSF1A是人类肿瘤中最常见的表观修饰位点之一［23］，其失活可促进下游 microRNA 21 表达、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）激活并消除p21和p27的抑制作用，从而促进细胞增殖［24］；细胞周期依赖性激酶抑制基因2A（CDKN2A）又称为p16基因，通过pRb-E2F通路在G1-S转换阶段负性调节细胞周期进程，其甲基化改变将会导致肿瘤异常增殖［25］；甘丙肽受体 1（galanin receptor，GALR1）和p15、p21基因［26］的甲基化与细胞循环相关；（2）抑制细胞凋亡。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种钙相关调节因子，可以通过p19ARF/p53通路调节细胞凋亡，在包括头颈部肿瘤在内的多种癌症中存在异常甲基化［27］；速激肽1编码P物质和神经激肽A可以通过激活ERK1/2和 NF-κB 信号通路促进增殖和抗凋亡［28］；隔膜蛋白9、钠碘转运体蛋白8、染色体18上功能性smad抑制部分（FUSSEL18）、早期B细胞因子3及IRX1可通过影响转化生长因子β（transforming growth factor β，TNFβ）干扰肿瘤凋亡［29］；（3）影响DNA修复。O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methyguanine-DNA methytransferase，MGMT）是一种对烷化剂造成的DNA损伤敏感的DNA修复酶，其可在接受烷化剂类化疗药治疗时保护正常细胞、防止二次癌变，但也会影响此类药物对肿瘤的效果［30］。MGMT过甲基化导致表达下降与头颈鳞癌有关，并具有双向作用，一方面促进肿瘤发生侵袭转移，同时也降低其对化疗的耐药性［31］；（4）促进远处转移。正常上皮细胞通过形成E钙黏蛋白（E-cadherin）-β连蛋白（β-catenin）复合物与其他细胞及基底膜相黏附，而头颈鳞癌中该位点的低表达与肿瘤局部侵袭及远处转移密切相关，可作为预后指标［32］；Ⅰ型胶原α2链是大部分组织连接处的纤维成分，其过甲基化同样导致增殖和转移增加［33］。

靶向DNA甲基化的治疗方案与基因突变不同，DNA甲基化为可逆性改变，体外实验证明逆转过甲基化的DNA位点能使其重新获得功能［34］。目前已有十余种抗甲基化药物得到美国FDA批准或处于临床实验，按其作用机制可分为广谱药物和靶向药物。DNMT抑制剂是经典的广谱抗甲基化药物，可以造成广泛去甲基化，从而逆转肿瘤特异性改变［35］。阿扎胞苷（5-azacytidine）、地西他滨（5-aza-2'-deoxycytidine）等药物抑制肿瘤的作用在临床试验中已得到验证［34］。目前靶向DNA甲基化的药物较少，IDH抑制剂AG-881、IDH305等可以稳定三羧酸循环、干扰TET及组蛋白的异常甲基化，在急性髓细胞白血病中起到积极作用［36］。但去甲基化药物的临床应用也存在风险，广泛去甲基化引起的基因不稳定性可能会导致细胞凋亡，甚至促进成瘤基因的激活［37］。研究提示特异基因去甲基化可以改善化疗药物的耐药性［38］，与化疗、免疫治疗等组成联合方案是目前去甲基化治疗的最佳方法。

结语DNA的异常甲基化（包括全基因序列的低甲基化和抑癌基因的高甲基化），在肿瘤发生中起到重要的作用。吸烟、长期酗酒、病毒感染被认为是头颈部肿瘤的易感因素，可以通过多种途径促进异常甲基化的发生，进而诱发正常组织癌变。目前针对 RASSF1A、CDKN2A、DAPK、MGMT、E-cadherin等位点的研究可能为完全揭示甲基化导致肿瘤发生的机制提供线索。液态活检技术的应用以及对癌前病变甲基化的监测可为肿瘤早期诊断提供便利。结合化疗、免疫治疗的甲基化靶向治疗有望为改善患者预后作出贡献。