啤酒花中槲皮素及山柰素的测定方法研究

邢潇　徐彤彤　梁玉冰　闫艳　李岩　刘治民

摘 要：通过对啤酒花中的槲皮素及山柰素的酸水解HPLC含量测定方法研究，为其质量标准的制定与开发利用提供依据。采用不同提取方法（溶剂、HCl浓度、HCl比例等）对其进行样品提取方法考察，确定色谱条件，并进行方法学考察研究。结果表明：该方法灵敏、精密度高、重现性好、结果准确、专属性强，可用于啤酒花中槲皮素及山柰素的测定。

关键词：啤酒花;槲皮素;山柰素

中图分类号：S-3 文献标识码：A DOI：10.19754/j.nyyjs.20201130007

啤酒花为桑科植物啤酒花（Humulus lupulus L.）的干燥雌花序，别名蛇麻草、唐草花、忽布、酵母花等，主产于东北、华北、山东、新疆等地。传统医学认为啤酒花有健胃消食、安神利尿、抗痨消炎等作用，对消化不良、腹胀、肺结核、膀胱炎、咳嗽、失眠、麻风等疾病均有疗效[1-3]。现代研究表明黄酮类化合物是啤酒花中的重要活性成分，是控制啤酒花药材质量的重要指标。但大多数黄酮类化合物在口服后，会经过酶的水解转变成相应的黄酮苷元被吸收，因此黄酮苷元的含量可以作为黄酮类物质有效成分的评估[4]。近年来研究表明，槲皮素可显著改善肺结核小鼠炎症反应，而啤酒花的一个重要功效就是治疗肺结核，这可能就与其含有此类抗氧化物质有关[5]。本研究选用啤酒花中水解黄酮苷元中的槲皮素、山柰素为指标，采用高效液相色谱法测定其含量，对啤酒花的质量进行评价。

1 仪器与试剂试药

Agilent 1260型号高效液相色谱仪;天津泰斯特仪器有限公司DK-98-11A电热恒温水浴锅;日本A＼＼D公司GR-202电子天平。

槲皮素对照品（批号：100081-201610）及山柰素对照品（批号：110861-201611）均购自中国食品药品检定研究院;色谱甲醇（Merck）;乙醇（天津市鑫铂特化工有限公司）等。在市场上购买12批啤酒花样品，经长春市食品药品检验中心教授鉴定为桑科植物啤酒花的干燥雌花序。

2 方法考察与结果

2.1 色谱条件

经DAD光谱在200～400nm进行扫描，考虑其基线平稳程度及最大吸收波长，结合文献查询，最终槲皮素及山柰素的测定波长为360nm。

采用Agilent5 TC-C18（2） （4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，分别以不同流动相（乙腈-0.4%磷酸、甲醇-0.4%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-水）比例、不同柱温、不同流速下进行比较。结果显示，甲醇-0.4%磷酸（48∶52）可以将槲皮素、山柰素成分进行有效分离，且不受柱温及流速的影响。

2.2 提取方法

由于槲皮素、山柰素为黄酮类化合物酸水解后的产物，因此提取溶剂中考虑加入HCl对其进行水解。

取样品粉末约0.2g，加入不同溶剂与酸混合的混合溶液，置水浴中加熱回流，按上述色谱条件进行样品提取溶剂（甲醇、80%甲醇、乙醇）、HCl浓度（50%、75%、100%）、甲醇-HCl比例（35∶15、40∶10、45∶5）、提取方式（超声、回流）及水解温度（75℃、80℃、85℃、90℃、100℃）的考察，以槲皮素和山柰素含量之和作为考察结果。结果表明，样品以甲醇-HCl（4∶1）溶液50mL做溶剂，置80℃水浴中加热回流30min，提取最为完全，分离效果好，见图1～3。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系考察

将槲皮素及山柰素对照品加甲醇制成含槲皮素9.940μg·mL-1、山柰素3.976μg·mL-1的溶液，摇匀，作为对照品溶液。分别精密吸1μL、5μL、8μL、10μL、15μL、20μL，注入液相色谱仪，绘制对照品的标准曲线。结果表明，槲皮素进样量在0.0099～0.1988μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=62753X+45.02，相关系数r=0.9999;山柰素进样量在0.0040～0.0795μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为Y=15688X+45.02，相关系数r=0.9999。

2.3.2 中间精密度

取同一批次啤酒花药材，按上述方法，在不同时间，由本实验室3名分析人员分别制备供试品溶液，分别用3台高效液相色谱仪，测定槲皮素与山柰素的含量并计算和，结果其平均含量为0.133%、n=3、RSD=0.6%，说明本方法的重复性良好。

2.3.3 准确度

取重复性试验同批次样品（槲皮素含量：0.0995%;山柰素含量：0.0350%）9份，每份取约0.2g，精密称定，再分别加入50%、100%、150%槲皮素对照品、山柰素对照品适量，按上述色谱方法进样，测定其中槲皮素、山柰素的含量，分别计算回收率。结果槲皮素平均回收率分别为99.9%、n=9、RSD=2.4%;山柰素平均回收率分别为88.4%、n=9、RSD=2.9%，说明本方法回收率良好。

2.3.4 耐用性试验

取同一供试品溶液，分别在在不同仪器（Agilent 1260、HP1100、岛津2010），采用不同品牌色谱柱：Agilent5 TC-C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）、Diamonsil C18（4.6×250mm，5μm）、TnatureC18（4.6mm×250mm，5μm），依上述色谱条件进行测定，结果显示供试品色谱中的槲皮素和山柰素色谱峰均能得到良好的分离效果，表明本方法耐用性良好。

2.3.5 稳定性考察

精密吸取同一供试品溶液10μL，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h进样，计算峰面积的RSD值，结果槲皮素与山柰素的平均峰面积和为4645.2、n=6、RSD=0.8%。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

2.4 样品测定

依上述方法测定12批样品，结果见表1。

3 讨论

文献表明，只用超声法或回流法对药材中的槲皮素和山柰素进行提取，其测定结果不稳定，无法真实表达样品中的黄酮类成分含量，因此本研究采用酸水解法进行啤酒花中槲皮素及山柰素的含量测定。方法学研究结果显示，该方法灵敏、精密度高、重现性好、结果准确、专属性强，且符合黄酮类化合物的实际代谢情况，可作为该品种的内在质量控制方法。结果显示，啤酒花样品中槲皮素与山柰素含量和在0.072%～0.175%差异较大，可能与产地、加工、生产、贮存等因素有关。希望本研究方法及样品实测结果可以在啤酒花质量标准的制定中作为参考及依据。

参考文献

[1]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1996：770-771.

[2]国家中药管理局编委会.中华本草：第2卷[M].上海：上海科学技术出版社，1999：511-514.

[3]南京中医药大学.中药大辞典[M].第2版.上海：上海科学技术出版社，2006：3015-3016.

[4]陈建忠，曾志伟，曾荣洁，等.酸水解提取HPLC法测定不同来源莲须中槲皮素和山柰酚的含量[J].药物分析杂志，2015，35（02）：355-359.

[5]陈振宇，缪利娅，朱银超.槲皮素对实验性肺结核病小鼠TLR4、TRAF6、IL-1β表达影响的研究[J].新中医，2019，51（10）：8-13.

（责任编辑 李媛媛）

收稿日期：2020-10-27

基金项目：吉林省中药材地方标准项目“中药材地方标准-啤酒花”（项目编号：2017-3）

作者简介：邢潇（1983-），女，博士，副主任药师。研究方向：中药材及饮片的质量评价及质量标准;通讯作者刘治民（1982-），男，硕士，主管药师。研究方向：中药材检验及质量评价。