半胱氨酸双加氧酶-1甲基化表达对于癌症早期诊断的意义研究进展

矗日雅，张生彬

（1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特；2.内蒙古包钢医院，内蒙古 包头）

0 引言

半胱氨酸双加氧酶-1是一种金属蛋白酶，其主要功能是参与半胱氨酸的调节和牛磺酸合成。半胱氨酸双加氧酶-1通常分布于细胞质中，由位于5q23.2的半胱氨酸双加氧酶-1基因转录表达[1]。近年来研究发现，在结直肠癌、乳腺癌及脑胶质瘤中的发生过程中半胱氨酸双加氧酶-1存在着表达失活，其启动子区高甲基化是导致基因功能异常的重要因素[2-3]。抑制半胱氨酸双加氧酶-1基因启动子区高甲基化可以恢复半胱氨酸双加氧酶-1的表达，抑制肿瘤细胞生长。由此认为半胱氨酸双加氧酶-1具有肿瘤抑癌基因的功能。在对肺癌的研究中发现，NSCLC中存在着普遍的半胱氨酸双加氧酶-1启动子区高甲基现象，认为半胱氨酸双加氧酶-1的甲基化对于NSCLC具有一定的特异性[4]。既往研究[5]表明，在表观遗传学水平上发生的DNA甲基化是抑癌基因转录失活的重要原因之一，属于肿瘤发生的早期事件。半胱氨酸双加氧酶-1基因属于肿瘤抑制基因，其失活的方式主要通过启动子的甲基化。对一些肿瘤特异基因的甲基化状态进行联合检测可提高肿瘤在血清学诊断水平上的灵敏度，为癌症患者的筛查及早期诊断提供新的临床诊断思路。

1 标本收集

研究组甲的标本为经过筛选的35例合格病例组及20例合格对照组组织及血清样本[6]。研究组乙的标本为经过筛选的49例合格病例组及16例合格对照组组织及血清样本[7]。实验组及对照组组织标本离体后立即置于液氮内保存备用。血清样本在患者空腹12h后于次日晨间抽取，高速离心机中3000r/min离心10min，吸取上层血清，封装于2mL冻存管中液氮内保存。

2 检测方法

2.1 研究组甲组采用基于磁珠的DNA提取和亚硫酸氢钠修饰技术

取血清样本1mL，加入组织裂解液及蛋白酶K于55℃消化3h后，加入磁珠（Promega公司），充分混匀后，直接采用磁珠抽提DNA；并采用Zymo公司EZ DNA Methylation kit直接在磁珠上对DNA进行亚硫酸氢钠修饰，最终获得可直接用于后续PCR扩增的DNA样本。取肿瘤标本中心部位组织10mg，加入适量液氮快速充分研磨至匀浆。加入组织裂解液及蛋白酶K过夜消化后，处理步骤同上。扩增CDO1基因，扩增引物由上海Invitrogen公司合成。PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液2.5 μl；10mmol/L dNTP混合液 0.5 μl；50mmol/L MgCl20.8μl；Platinum Taq DNA 聚合酶0.2 μl；上游及下游引物各 1 μl；2 μl修饰后的 DNA 模板；双蒸水17 μl；总体积共 25 μl。反应条件如下：95℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，共循环 45 个周期；72℃终末延伸5min。采用2-ΔCT法判断实时定量PCR阳性结果[4]。

2.2 研究组乙组采用AxyPrep基因组DNA试剂盒说明对血清标本的DNA进行提取，并应用紫外分光光度计检测提取的DNA含量和纯度。准备DNA样品，体积20μl，总量约500ng，根据MethylCodeTMBisulfiteConversionKit试剂盒说明行亚硫酸氢钠修饰。对亚硫酸氢钠处理后的样本DNA行PCR扩增引物由上海Invitrogen公司设计。PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液2.5 μl；10mmol/LdNTP 混合液 0.5 μl；50mmol/LMgCl20.8μl；PlatinumTaqDNA 聚合酶0.2μl；上游及下游引物各1μl；2μl修饰后的DNA模板；双蒸水17μl；总体积共25μl。反应条件如下：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循环35个周期；72℃终末延伸5min。MSP产物混合适当的上样缓冲液，于3.0%琼脂糖凝胶电泳。

3 结果

经统计学处理后发现：甲组病例组半胱氨酸双加氧酶-1基因甲基化检测率为71.4%（25/35），对应的血清检出率为51.4%（18/35）。对照组中半胱氨酸双加氧酶-1基因甲基化率为10.0%（2/20），对应的血清检出率为5.0%（1/20），肿瘤组与对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。乙组病例组半胱氨酸双加氧酶-1基因甲基化率为42.9%（21/49），对应的血清检出率为34.7%（17/49）。所有对照组血浆未检出CDO1基因甲基化，病例组与对照组之间差异有统计学意义（P＜0.01）。并且上述两例研究中发现组织与血清中甲化检出率的一致性较好。虽然上述两例研究中样本数量有一定的差距，但研究实验结果表明，病例组血清中半胱氨酸双加氧酶-1基因甲基化率要高于对照组，病例组与对照组之间差异均有统计学意义（P＜0.01）。且不论是在组织样本中还是在血清样本中，半胱氨酸双加氧酶-1的检出率均高，证明其一致性是可靠的。在单因素分析显示患者血清半胱氨酸双加氧酶-1基因的甲基化与年龄、性别、肿瘤分级无关。

4 讨论

研究证实半胱氨酸双加氧酶-1作为一种具有抑癌基因功能特征的基因，其基因启动子区高甲基化与食管鳞癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌等肿瘤的预后密切相关。研究认为半胱氨酸代谢途径在肿瘤细胞的侵袭过程中发挥着重要作用。半胱氨酸双加氧酶家族主要包括半胱氨酸双加氧酶-1和半胱氨酸双加氧酶-2两个成员[2-4]。半胱氨酸双加氧酶-2是一种膜结合蛋白；半胱氨酸双加氧酶-1是半胱氨酸分解代谢过程的关键酶，主要分布于细胞质中，其基因启动子区异常高甲基化引起基因表达下调，从而影响半胱氨酸代谢，细胞代谢异常，最终导致肿瘤的发生发展。

Brait et al[1]研究得出在不同肿瘤组织中半胱氨酸双加氧酶-1基因也都存在异常的高甲基化，并表现其相应信使RNA和蛋白质表达下调。研究显示恶性肿瘤患者外周血中的游离DNA含量较高，这些小片段，半衰期短，极易降解的游离DNA多是由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放而来。一些特异基因启动子常常被检测出处于高甲基化状态，并且这种状态的改变总伴随于肿瘤细胞内的抑癌基因的甲基化改变而发生，同时在遗传特性上的两者变异是一致的。目前已经可以从外周循环血中检测到肿瘤相关的基因突变，如EGFR，Kras等，然而DNA甲基化的检测仍是一个难点[7]。

在方法学方面，甲组研究人员认为传统的亚硫酸氢钠修饰过程中会损失大量的DNA，这对于原本就很微量的循环血游离DNA检测而言，在很长时间里都是难以逾越的障碍。上述研究中采用的基于磁珠的DNA提取和亚硫酸氢钠修饰技术，在亚硫酸氢钠修饰过程中最大程度减少了DNA的损失，并采用实时定量PCR技术检测DNA甲基化信号，极大地增强了检测的灵敏度和特异性。乙组研究人员认为MSP法检测DNA甲基化是一种简单、精确、高效、价格适中的检测方法。首先，在肿瘤细胞及其相应的正常细胞中，对完全相反状态（纯合甲基化或去甲基化）的靶基因，MSP法能够从多达104个正常细胞中检测出1个肿瘤细胞。其次与定量性表达性指标相比，DNA甲基化（为定性指标）状态不易受患者体内肿瘤因素的影响，使得对肿瘤样品中非肿瘤细胞污染有高度的抗性。在两组实验结果发现血清检测半胱氨酸双加氧酶-1启动子区甲基化与直接从肿瘤组织中检测在结果上具有极高的一致性，这提示血清检测DNA中半胱氨酸双加氧酶-1甲基化对癌症进行诊断和监测是可行的。

在统计学资料方面，两组实验的样本数量并不大，如果增加样本含量其半胱氨酸双加氧酶-1的甲基化检出率是否会出现误差还有待研究。且这种单基因的甲基化检测是否会出现漏诊的情况还未知，其组织样本中是否会出现“假阴性”结果还有待考证，其灵敏度还需大样本的临床研究支持。所以在下一步应尽量增加样本含量，增加其半胱氨酸双加氧酶-1的甲基化检出率的灵敏度，在增加样本含量的同时是否可以采用联合基因检测以提高其灵敏度，并且应进一步完善肿瘤DNA甲基化谱。尽量减少实验步骤以减少系统误差，避免出现“假阴性”或“假阳性”结果。

综上所述，研究发现某些癌症患者血清DNA中存在半胱氨酸双加氧酶-1基因启动子区的异常甲基化状态，且具有极高的特异性，在早期诊断中具有深远的意义，同时血清标本极易获得，这又使被检人群具有良好的依从性。血清游离DNA中半胱氨酸双加氧酶-1的甲基化检测可能为癌症的早期诊断提供全新的临床思路及价值。