叶酸水分检测的研究

潘波 陈喜生

(1.国药控股股份有限公司，上海 200030；2.国药控股星鲨制药(厦门)有限公司，福建 厦门 361026)

0 引言

叶酸是指必需的水溶性B族维生素类药物，由三个部分组成：蝶啶环，对氨基苯甲酸酯和谷氨酸。多官能团的结构赋予了叶酸复杂化学性质，使得叶酸较易含有结晶水和吸附水[1]，稳定性受到pH，温度，光线，氧化剂和还原剂的影响。在受热的情况下，叶酸通常通过在C9-N10处裂解而降解，生成6-甲酰基蝶呤和氨基苯甲酸[3]，因此，干燥失重测水分的方法不适用于叶酸。目前《中华人民共和国药典》以下简称《中国药典》)2015年版采用卡尔费休法进行水分测定[3]，叶酸的水分在测定时释放缓慢，使得水分检测时间较长[4]，增大了环境因素对检测结果的影响。通过将叶酸样品中的水分转移到易释放水分的溶剂中，设置转移所需要的萃取时间，避免滴定过程提前结束，使叶酸水分释放更充分。因此，本文采用三氯甲烷-无水甲醇萃取水分的溶剂，使用万通915卡式费休水分测定仪测定叶酸水分，通过研究萃取时间与水分检测结果的关系，确定最佳萃取时间，以提高卡尔费休法测定叶酸水分的准确性。

1 仪器、试剂与样品

1.1 仪器与试剂

卡氏水分仪(915，万通)，电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；卡尔费休试剂(3.6mg/mL)，甲醇(分析级)，三氯甲烷(分析纯)均来自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 样品来源

叶酸对照品来自中国食品药品检定研究所；叶酸样品来自河北冀衡(集团)药业有限公司。

2 试验方法

2.1 反应时间对叶酸水分检测的影响

按照药典准确称取纯化水10mg，用水分测定仪进行标定。另作空白试验，计算[3]。按照药典准确称取供试品0.1g，溶剂为无水甲醇，用水分测定仪直接测定，获得水分含量[3]。

2.2 设备相关参数

万通915卡氏水分仪方法设置参数为：“滴定速度”设置为最优；“停止判据”设置为“漂移”；“停止漂移”为20μL/min；“漂移校正”设置为自动；进行水分测定的“萃取时间”分别设置为0～400s。

3 结果与分析

3.1 供试品水分测定结果与分析

在不同萃取时间下，滴定过程中消耗的卡尔费休试剂量与滴定时间的关系如图1所示，萃取时间的延长，维持高速滴定反应的时间延长，水分释放更加充分。随后反复出现滴定启动与中止交替现象，每次滴定的体积减少，中断的时间增加。随着滴定反应的进行，反应体系的水分越来越少，水分释放速度越来越慢，当滴定反应消耗水的速度大于体系所能够提供水，阈值范围内不能满足启动滴定反应的要求则检测过程结束。

图1 不同萃取时间卡尔费休试剂的消耗情况

萃取时间设为400s，在滴定反应的0～21s内，萃取剂中的水分高速释放，反应体系水分充足，滴定速度恒定，出现卡尔费休试剂高速消耗的现象。在滴定反应的21～400s内，滴定过程频繁出现中止又继续进行滴定的现象，启动滴定系统进行滴定反应的时间越来越长，说明从叶酸样品向滴定体系释满足最小滴定体积的卡尔费休试剂完成反应所需要水的时间越长，再次启动滴定消耗的卡尔费休试剂的体积越少，说明从叶酸样品向滴定体系释补充水的量越少。

证明叶酸样品在水分释放过程中，叶酸样品本身的水分含量越来越低，释放水分的速度越来越慢。由图2a水分含量与反应时间变化关系可以看到，在滴定过程的0～200s，随着反应时间的延长，测出的水分含量越来越高，增长的幅度越来越小，在滴定过程的200～400s，随着反应时间的延长，测出的水分含量呈现正相关关系，如图2b相关性系数R=0.9994，相关系良好，说明水分增速恒定。但与上述叶酸样品在水分释放过程中速度越来越慢的现象矛盾，证明叶酸样品在250s后水分释放不是导致检测水分上升的主要原因，叶酸样品释放水分远小于其他方面的水分来源，滴定体系中的水分来源于滴定体系周围相对恒定的环境。

水分含量与萃取时间的变化关系如图2c所示，萃取时间在0～400s内，随着时间延长，样品中检测出来的含水量越高，延长萃取时间使得叶酸中的水分释放更加充分，含水量的检测结果更加准确。萃取时间超过200～400s后，水分含量与萃取时间呈正比关系，如图2d所示，并且相关系数R=0.9993，线性关系良好，水分含量的增量恒定，与样品水分释放逐渐减慢不相符，说明启动设备进行滴定反应的这部分水来源不是由样品中的水分释放导致，可能是由于周围环境中的水分进入以恒定的速度进入萃取体系导致，即叶酸样品在萃取阶段的第200s至400s释放的水分趋近于0，延长萃取时间不会使得样品中的水分萃取率提高，因此可以将200s作为最佳萃取时间。

延长萃取时间有利于叶酸样品充分释放水分，但增大了环境因素提高叶酸检测结果的风险，从避免延长萃取时间环境中的水分检测影响，使样品中的水分充分释放的角度考虑，显然萃取200s是萃取的最佳时间。

图2 滴定过程的水分变化情况

3.2 叶酸对照品的水分测定的结果与分析

在对照品的检测过程中，检测到叶酸中含有7.78%的水，另外，李娜等[2]关于叶酸标准品的研究报道显示叶酸标准品含有7%～9%的水分，均印证叶酸易吸收水分与携带结晶水的特性，通常以含水的混合物形式存在。在《中国药典》2015版中对于叶酸的分子式书写成C19H19N7O6[4]，描述了叶酸的活性部分，不能体现叶酸供试品、对照品与标准品通常以含水的混合物的形式存在，而对叶酸活性部分的物质含量检测具有重要影响。建议将叶酸的分子式书写成C19H19N7O6,xH2O，能够直观体现叶酸主要以含水的混合物形式存在。

4 结语

水分测定的结果将会影响原料的含量测定以及对照品赋值结果的准确，本文采用万通915卡尔费休水分测定仪测不同萃取时间下叶酸水分的含量，确定在滴定前将叶酸样品的水分萃取时间设为200s，能够更加精确测得叶酸样品中的水分含量，为叶酸水分的质量标准制定提供参考方法。

在叶酸的样品与对照品的研究过程中，以及已报道的关于叶酸标准品的研究过程中，均检测到7%～9%的水分。建议将叶酸的分子式书写成C19H19N7O6,xH2O，有助于研究人员、检测人员、公众等对叶酸的认识更加直观。