甲基汞暴露致学习记忆功能障碍作用机制的研究进展

张 力，张爱华，王文娟*

(贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室/公共卫生学院，贵州 贵阳 550025)

汞(Hg)是一种有毒的重金属元素，被世界卫生组织列为对公众健康危害最大的10 种化学品之一。 甲基汞(methylmercury，MeHg)在所有汞化合物中毒性最强[1]。甲基汞主要是汞化合物在水体环境中通过微生物的转化作用而自然产生的一种有毒化合物，其通过食物链传递，进行高度的生物富集[2]。由于甲基汞具有亲脂性，易通过胎盘屏障，胎儿和新生儿极易受到甲基汞的毒性损害，因此，发育过程中的中枢神经系统(central nervous system，CNS)十分脆弱，是甲基汞毒性的主要靶点[3]。

甲基汞作为一种针对神经发育的毒性物质，其毒性机制和毒性效应一直引起人们的广泛关注。震惊全球的日本水俣病事件揭示了长期暴露在高毒性的甲基汞环境中会导致机体感觉障碍、共济失调等各种神经系统疾病；先天甲基汞中毒的胎儿可见广泛的脑部病变且表现出脑瘫和严重发育迟缓的症状[4]。

众所周知，大脑的学习记忆是一个非常复杂的生理过程，目前甲基汞暴露对大脑学习记忆的影响及其机制尚不明确。本文就甲基汞早期暴露致学习记忆功能障碍的作用机制进行简要综述。

1 氧化应激

氧化应激会导致大鼠的学习记忆功能受损，被认为是甲基汞神经毒性的重要机制之一。谷胱甘肽系统在维持大脑的氧化平衡方面发挥着重要作用。研究发现[5]，宫内甲基汞暴露会破坏出生后仔鼠大脑中谷胱甘肽抗氧化系统的发育，导致谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性下降。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在控制活性氧(reactive oxygen species，ROS)过度产生方面发挥着重要作用，Liu等[6]研究表明，甲基汞可致细胞内SOD的活性呈剂量依赖性下降。因此，甲基汞通过抑制细胞内抗氧化酶的活性，进而诱发ROS产生并作用于线粒体。

线粒体富含硫醇蛋白质，它不仅是甲基汞蓄积的主要场所，还是甲基汞毒性作用的靶向细胞器[7]。氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)是细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的主要来源，线粒体电子传递链酶复合体的活性降低会导致ATP合成障碍。甲基汞暴露可使线粒体中OXPHOS、电子传递链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性下降，线粒体DNA过度损伤，导致ATP合成减少，诱发线粒体功能障碍，进一步促进ROS的生成，形成ROS过度生成的恶性循环，最终导致线粒体应激[8]。另外，在神经元细胞中，异常升高的ROS将会破坏胞内稳态，导致动力相关蛋白1激活、视神经萎缩症蛋白1失活和线粒体碎片化，最终导致神经元细胞死亡，引起学习记忆功能障碍[9]。

总之，甲基汞暴露导致细胞内抗氧化酶的活性下降，诱发线粒体应激导致线粒体ATP合成功能障碍，ROS过度产生，诱发氧化应激，进而使神经元细胞数量减少导致大脑的学习记忆能力下降。

2 谷氨酸过度激活

谷氨酸作为兴奋性神经递质，介导中枢神经系统2/3 的突触传递，在学习记忆、突触可塑性以及大脑发育过程发挥着重要作用[10]，其受体分为离子型和代谢型。其中离子型谷氨酸受体又分为3种亚型：α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙氨酸(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid，AMPA)受体、N-甲基-d-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体和红藻氨酸(kainic acid，KA)受体。

谷氨酸/天冬氨酸转运蛋白(glutamate-aspartate transporter，GLAST)和谷氨酸转运蛋白-1(glial glutamate transporter-1，GLT-1)是星形胶质细胞摄取谷氨酸的主要通道，负责调节细胞外的谷氨酸水平。神经细胞暴露于甲基汞后，由于产生过量的ROS而引起GLAST和GLT-1表达均明显下降，由此导致谷氨酸在胞外大量蓄积，从而导致NMDA 受体的过度激活[11]。Beattie等[12]的实验证明了NMDA 受体的激活可介导Ca2+内流而激活钙调神经磷酸酶的活化从而诱发AMPA 受体内吞。AMPA 受体的内吞导致长时程抑制形成而导致突触的数量减少，被认为是大脑遗忘的分子基础。

高浓度的Ca2+会破坏钙稳态，引发信号通路的紊乱，使神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的活性增强、OXPHOS、线粒体活性失调和内质网应激等，从而导致细胞膜去极化和胞内细胞器功能紊乱[13]。一般认为，nNOS活性的增加会导致一氧化氮(nitric oxide，NO)生成增多，NO合成量的增加被认为是一些神经退行性病变神经元死亡的重要原因[14]。内流的Ca2+通过钙调蛋白(calmodulin，CaM)激活nNOS 从而产生过量的NO，其可与·-O2形成具有强氧化毒性的过氧亚硝酸根，因此过量产生的NO最终会导致神经元细胞死亡[15]。

总之，甲基汞暴露导致胞外谷氨酸蓄积，使NMDA受体过度激活，细胞内Ca2+超载，诱发NO的神经毒性作用，导致神经元细胞死亡，使学习记忆功能受损。

3 NMDAR异常表达

N-甲基-d-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)是由神经递质谷氨酸控制的阳离子通道，主要存在于CNS谷氨酸能突触的突触后侧和突触前侧，被认为是学习和记忆的基础，目前已经确定的NMDAR 亚基共有7 个：1 个NR1、4个NR2(A、B、C和D)和2个NR3(A、B)亚基[16]。

当CaM增加时，细胞会反馈性调节钙蛋白酶活力增加，暴露于甲基汞后，钙蛋白酶活力明显升高，NMDA 受体的mRNA和蛋白质表达水平均出现不同程度的降低，可能是由于细胞内钙超载反馈性调节钙蛋白酶活力升高，钙蛋白酶水解CaM的同时降解NMDAR，导致NMDAR 表达下降[17]。王欣梅等[18]证实了大鼠在出生后第1、2周暴露于甲基汞会导致学习记忆能力明显下降，且NMDAR2 的mRNA 表达异常，推测当甲基汞诱发NMDAR 表达异常特别是NMDAR2 的表达异常时会引起学习记忆能力的下降。

4 铁死亡

2012 年Dixon 等[19]首次发现了一种新型的细胞死亡方式——铁死亡(ferroptosis)，它是一种铁依赖性的、以细胞内脂质活性氧(lipid reactive oxygen species，L-ROS)蓄积为特征的细胞死亡，在细胞形态、生化和基因水平方面与细胞凋亡、坏死和自噬有明显的差异。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)是一种含有硒基的降脂酶，可以降低脂膜中的过氧化物，抑制其活性是诱导细胞发生铁死亡的重要因素之一[20]。研究表明[21]，甲基汞暴露可使GPX4的活性和表达均降低。GSH对于GPX4发挥功能至关重要，其合成直接影响GPX4活性发挥，而甲基汞可使细胞内GSH的合成减少。氧化应激产生的ROS可与脂质膜上的多不饱和脂肪酸相互作用形成可致细胞死亡的L-ROS，而GPX4 则可抑制L-ROS 的积累，当GPX4活性下降则会导致L-ROS的积累从而诱导细胞发生铁死亡[22]。

抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运体(cystine/glutamate antiporter system，System Xc-)是诱导细胞发生铁死亡的重要机制[23]。System Xc-是细胞内重要的抗氧化体系，可介导谷氨酸的胞外转运和胱氨酸(cystine，CySS)的胞内转运并参与细胞内GSH 的生物合成。甲基汞暴露引起细胞外谷氨酸含量过高时，System Xc-则会抑制细胞对CySS 的摄取，而CySS 是GSH 生物合成的重要物质，抑制System Xc-而导致细胞内CySS 和GSH 含量减少，进而导致神经元上自由基的积累，最终导致细胞铁死亡的发生[13]。

铁死亡的概念自从被提出后便逐渐成为科学研究的热点，但是目前关于甲基汞诱发细胞铁死亡机制的研究还不够成熟，因此关于甲基汞诱发细胞发生铁死亡对大脑学习记忆的影响机制还需要进一步的探讨和阐明。

5 自 噬

自噬，又称为Ⅱ型程序性细胞死亡，是一种高度保守的细胞代谢的过程，由溶酶体介导对细胞内组分和细胞器的降解，在维持细胞的物质能量平衡方面发挥着重要作用，被认为有利于细胞的存活。既往研究认为，在进化上高度保守的细胞自噬是一种非选择性的维持细胞稳态的过程，可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，目前研究最广泛的是巨自噬[24]。哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin，mTOR)，是一种由人类mTOR 基因编码产生的蛋白激酶，激活mTOR 抑制自噬，抑制mTOR 激活自噬，激活mTOR 会下调空泡型ATP酶的表达，破坏溶酶体和自噬酸化，引起自噬功能障碍[25]。研究发现，人神经干细胞暴露于甲基汞(0.01～1 μmol/L)后，mTOR 水平呈剂量依赖性下降，表明甲基汞过度激活自噬，导致自噬系统失调[26]。不过，目前关于甲基汞抑制mTOR 表达的机制有待探究。

自噬发生后，自噬微管相关蛋白轻链3(light chain 3，LC3)首先被自噬相关蛋白4(autophagy related protein 4，Atg 4)分解成LC3-Ⅰ(胞质形式)，然后Atg4/Atg5/Atg16L 复合物介导LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合生成LC3-Ⅱ(脂化形式)[27]。甲基汞暴露后细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，则说明自噬活性增强[28]。Fang等[29]研究了自噬在甲基汞诱导的星形胶质细胞神经毒性中的作用，发现甲基汞诱发了细胞自噬并以浓度和时间依赖的方式降低星形胶质细胞的活力，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增加。Lin等[30]研究发现甲基汞通过增强神经细胞的自噬促进了自噬小体的积累，下调JNK/Vps34复合自噬诱导通路可减少自噬小体积累，减少甲基汞诱导的神经元细胞死亡，证实了甲基汞暴露导致溶酶体降解功能受损，通过JNK/Vps34复合通路诱导自噬小体的积累和神经元细胞死亡。

在正常的生理条件下，Kelch 样ECH 相关蛋白1(Kelchlike ECH-associated protein 1，Keap1)和核因子E2 相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)在细胞质中结合形成Keap1-Nrf2复合物，其在保护细胞免受氧化应激损害的方面发挥着重要作用。当Keap1中的巯基被亲电性的甲基汞修饰后，Nrf2 被激活，从而导致Nrf2 和Keap1 解离，并从细胞质转移到细胞核[31]。当Nrf2 和Keap1 之间的相互作用被破坏时，抑制Nrf2蛋白酶体的降解，促使Nrf2在细胞内重新生成，导致Nrf2向细胞核的转位增加，而核内增加的Nrf2可诱导激活抗氧化应答元件(antioxidant responsive element，ARE)，进一步保护细胞免受损害。Yang等[32]实验表明，Nrf2/ARE通路的激活可保护星型胶质细胞免受甲基汞的毒性损害。泛素结合蛋白(ubiquitin binding protein，P62)是一种自噬衔接蛋白，可将自噬和Keap1-Nrf2 通路连接起来[33]。暴露于甲基汞后P62 的表达增加[34]。增加的P62可与Nrf2竞争性地结合Keap1，导致Keap1通过自噬而降解，而P62 可再次诱导Nrf2 激活，在P62 和Nrf2之间形成正反馈环路，对细胞具有保护作用[33]。P62-Keap1-Nrf2通路可保护细胞免受氧化应激的损伤，其与细胞自噬之间有一定的联系，但具体机制有待研究。

目前，国外关于该方面的研究甚少，国内亦尚未见系统的报道，因此关于甲基汞诱发细胞自噬的机制有待深入探究。

6 表观遗传修饰

近年来，表观遗传修饰已逐渐成为神经发育研究的热点，其调控机制主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰和微小RNA(microRNA，miRNA)调控。研究表明，在大脑结构如海马和前额叶皮层中，与突触可塑性和突触结构相关的一些基因会由于表观遗传修饰的改变而发生变化[35-36]。

miRNA是一类长约20～24个核苷酸的非编码RNA，其可参与调控多种基因的表达。近年来发现的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)在控制基因表达方面发挥着关键作用，部分ncRNA通过靶向相关铁蛋白来调节铁死亡[37]。MiR-30b-5p是一种来自人胎盘的ncRNA。Zhang 等[38]在子痫前期模型中研究发现抑制miRNA-30a-5p的表达可上调膜铁转运蛋白和胱氨酸谷氨酸转运蛋白的表达，从而减轻细胞发生铁死亡。关于甲基汞致铁死亡的机制尚未见详细报道，而对于ncRNA在铁死亡中作用的研究更是少之又少，因此未来还需继续开展相关的研究。

DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，相关DNMT催化甲基通过一定的方式转移到胞嘧啶的第5位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。研究发现[39]，抑制NMDA 受体的激活可以阻断记忆相关的脑源性神经营养因子DNA的去甲基化，说明了通过NMDA受体传递信号对于DNA 去甲基化至关重要，暗示DNA 甲基化是NMDA 受体的一个靶点目标，但这其中更多的机制还需继续深入探究。

神经元分化阶段被认为易受化学物质诱导的表观遗传变化的影响，Go等[40]将组蛋白修饰作为表观遗传变化的代表，研究了在体外神经元分化模型中，甲基汞导致酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因的表观遗传抑制。该研究发现，细胞经甲基汞染毒后，与转录抑制相关的组蛋白H3K27me3在多巴胺合成的限速酶TH基因启动子区的表达显著增加，通过增加与TH启动子区转录抑制相关的组蛋白修饰，导致TH表达显著降低。

表观遗传修饰在学习记忆中的调控机制已成为神经发育研究的热点，关于甲基汞暴露致表观遗传修饰改变对大脑学习记忆的影响，尚需进一步的研究。

7 展 望

甲基汞的神经毒性效应及其机制一直以来都是科研工作者研究的热点。铁死亡和自噬在学习记忆中的作用机制也日益受到关注，然而目前国内外关于甲基汞诱导细胞发生铁死亡和自噬的研究相对较少，尚有诸多问题需进一步探讨，今后有望成为研究的重要方向。因此，深入研究上述的几种机制可为今后甲基汞暴露致学习记忆功能障碍的研究提供更多科学依据，对今后甲基汞诱发子代神经系统损伤的防治具有重要意义。