3个不同品系中华鳖间外形、核型以及乳酸脱氢酶同工酶表达的差异

张林，周剑光，张涛，何力

(中国水产科学研究院长江水产研究所， 农业农村部淡水鱼类种质监督检验测试中心， 湖北 武汉 4300223)

中华鳖(Pelodiscussinensis)属爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Chelonia)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus)，俗称甲鱼、水鱼或团鱼[1]。分布区域较广，在俄罗斯(东部)、越南(北部)、中国、韩国及日本等国均有分布[1-2]。在中国除新疆、西藏和青海外，都有分布，主要生长在华南地区和长江流域[1,3]。中华鳖主要有黄河品系、日本品系、淮河品系、台湾品系、洞庭湖品系及鄱阳湖品系，在生产性状、体表颜色和裙边大小等方面都存在一定差异。黄河品系、日本品系及淮河品系因生长速度较其他品系快、抗病性强、品质好、繁殖力强且耐存放运输等特性而成为主要养殖品系。中华鳖因肉味鲜美，含钙、铁、磷、核黄素、硫胺素、尼克酸、蛋白质和维生素等多种营养元素，尤以裙边富含胶原蛋白，备受人们喜爱[4-5]。此外，中华鳖也具有很高的药用价值[5-7]。因此，近年来，中华鳖作为重要的名优经济特种水产品种，养殖业快速发展，产量持续增长，每年产量高达32万 t，畅销国内外市场[5]。然而养殖场(户)不规范引种、倒种，忽视培育品种等行为导致中华鳖种质情况混乱，造成了部分种群的混杂和优良种质特性退化，如造成中华鳌生长速度减慢、抗病抗逆性能下降、生长规格不整齐和畸形率增加等[6]，严重破坏了中华鳖的种质资源。种质是产业的源头，关系着养殖户的切身利益，因此，对中华鳖种质资源进行评估与保护迫在眉睫。

目前对中华鳖的种质资源研究报道不多见，仅限于采用框架测量方法进行形态差异性分析[8]。本研究以淮河品系、黄河品系和日本品系中华鳖为研究对象，采用传统的形态学鉴定方法[9]，结合经典的细胞[10]及生化遗传[11]特性进行差异性比较分析，旨在为其种群鉴定、种质标准制定、种质资源评估及今后中华鳖新品种(系)的选育提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本试验选用健康的淮河品系、黄河品系和日本品系中华鳖，每个品系雌雄各30只，随机抽样，均为池塘养殖的2～3龄中华鳖，体质量无显著差异。且均采集于安徽省喜佳农业发展有限公司，所有品系的中华鳖饲养条件一致。雌雄性别通过外部形态特征技术确定。

1.2 形态学数据测量

参照《中华鳖》(GB 21044—2007)[9]，测定了3个品系中华鳖的11项形态学指标，包括体质量、背甲长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽、体高、吻长(上颌前缘至眼睛之间垂直距离)、吻突长(鼻孔前端无骨部分长度)、眼间距(两眼框上缘之间的距离)、吻突宽(吻端最大的宽度)和后侧裙边宽(尾基部上方裙边宽度)。可量参数用游标卡尺测量(精确度为0.01 mm)，体质量采用电子天平进行测量(精确度为0.01 g)。

1.3 数据分析

可测量形态学指标用SPSS 11.0软件(美国，SPSS公司)进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，然后采用Duncan法作群体间差异显著性检验。

1.4 染色体的制备

3个不同品系的中华鳖雌雄各3只，按照5 μg/g的剂量由后腿肌肉和腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，饲养24 h后，按照2 μg/g的剂量由后腿肌肉注射秋水仙素，3 h后断头放血取腿骨及脊椎。将腿骨及脊椎剪成1 mm3，然后在直径10 cm的研钵中加入3～5 mL生理盐水研磨，静置10 min，取上层细胞悬液1 000 g离心6 min，沉淀加入0.0375 mol/L的KC1溶液 5 mL，室温低渗45 min。加少许卡诺氏固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1，V/V)预固定1～2 min 后，1 000 g离心6 min，沉淀加入预冷的卡诺氏固定液，吹打均匀后室温静置30 min固定，以1 000 g离心6 min，离心后去上清液。如此重复3次后，取沉淀加少量固定液混匀后用空气干燥法制作涂片，涂片用15%Giemsa液染色。

1.5 染色体观察与指标测量

在显微镜(Olympus IX83)下用16倍目镜和100倍油镜观察拍摄，对采样的每只鳖均进行随机拍摄，每个品系至少拍摄100张清晰的中期分裂图。进行数据统计，确定染色体众数。染色体大小用Photoshop Software 7.0测量。每个品系挑选具有代表性的5张中期分裂图，按照着丝点分割点位置对染色体进行排号(1～66)，测量每条染色体的长臂长、短臂长和总长。每对同源染色体，取5对短臂与长臂均值，计算相对长度、着丝粒指数和臂比等，用SPSS 11.0软件进行统计分析，按照组型归类。

1.6 染色体配对

染色体的配对参考文献[10,12]的方法。着丝粒指数(CI)指每对染色体短臂均值长与此对染色体总长之比。相对长度指每对染色体总长和所有染色体总长之比。根据同源染色体总长及着丝粒位置的最大相似性进行配对。臂比指长臂长与短臂长之比。按臂比及着丝粒指数将染色体分为4组：中部着丝粒染色体M组，臂比为1.00～1.70，CI为0.375～0.500；亚中部着丝粒染色体SM组，臂比为1.71～3.00，CI为0.250～0.375；亚端部着丝粒染色体ST组，臂比为3.01～7.00，CI为0.125～0.250；端部着丝粒染色体T组，臂比为7.01～∞，CI为0.000～0.125[12]。在每组内根据同源染色体长度逐渐下降的顺序排列。

1.7 单态同工酶制备及测定

1.7.1 同工酶样本的制备

每个品系选取20只鳖，首先剪断颈动脉放血，在低温条件下(冰上操作)迅速解剖，取出脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉和眼晶状体7种组织，在玻璃匀浆器中匀浆(冰水浴中)，组织和提取缓冲液质量体积比为1∶3，提取液为0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.1)，4 ℃下12 000 g离心20 min后取上清液，重复离心2次，上清液置于-80 ℃下保存备用。

1.7.2 同工酶的筛选与电泳

为从生化遗传的角度区分鉴别3个品系中华鳖，首先在所测样本中每个品系选取8只鳖，取心、肝、脾、肾、肌肉和眼进行乳酸脱氢酶(LDH)、酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)、醇脱氢酶(ADH)、山梨醇脱氢酶(SDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)及葡萄糖磷酸变位酶(PGM)聚丙烯酰胺凝胶电泳，确定某种组织的某种同工酶是单态，再从所测样本中随机抽取10只健康鳖对该组织该同工酶进行验证，以初步确定该品系特有的生化遗传标记。

采用分离胶7.5%，浓缩胶3.5%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电极缓冲液为pH 8.3的Tris-甘氨酸，以220 V稳压电泳，4 ℃条件下，电泳5 h。至溴酚蓝指示剂至凝胶底部时停止电泳。电泳结束后将凝胶板取下，在染色液中避光染色至条带出现，显色至出现清晰条带后固定[11-13]。

2 结果与分析

2.1 3个品系中华鳖形态特征差异性比较

3个品系中华鳖外观形态特征如图1所示。日本品系中华鳖背部是暗绿色，淮河品系背部呈黄褐色，而黄河品系背部呈黄褐色或土黄色。日本品系背甲后部表皮上有突起的小疣突，而淮河品系和黄河品系背甲表皮上有突起的小疣突，尤以后部明显且集中，3个品系背甲后部是否有明显且集中的小疣突，是区分三者的重要标志之一。日本品系腹甲中心及后约1/4处未见淡绿色斑块，而淮河品系及绝大多数黄河鳖腹甲中心及后约1/4处隐约可见2个淡绿色斑块，腹甲是否有淡绿色斑块可以初步从外观上将日本品系与其他两个品系区分开。此外，黄河品系的裙边相对其他2个品系的裙边较宽，而淮河品系以背甲最宽处为界，背甲后部宽度明显比前部窄许多，此特征使淮河品系可区别于日本品系及黄河品系。3个品系中华鳖外部形态特征差异性描述见表1。雄性淮河鳖及雌性黄河鳖背甲宽/背甲长的比值与其他鳖差异显著，雌性怀河鳖体高/背甲长与其他鳖差异显著。雌性日本品系后侧裙边宽/背甲长差异明显。3个品系鳖的吻长/背甲长、吻突长/背甲长、吻突宽/背甲长、眼间距/背甲长差异均不明显。3个品系中华鳖形态学指标见表2。

图1 3个品系中华鳖正面背面图a～c分别为淮河品系、日本品系及黄河品系中华鳖背面;d～f分别为淮河品系、日本品系及黄河品系中华鳖腹面。Fig.1 The back and abdomen profile of three strains of Chinese turtlea-c:is the back of Huai River strain, Japanese strain and Yellow River strain respectively;d: The abdomen of Huai River strain of Chinese turtle d-f was the abdomen of huai River strain, Japanese strain and Yellow River strain.

表1 3个品系中华鳖外部形态特征差异性比较Tab.1 Comparison of external morphological characteristics of three strains of Chinese turtle

表2 3个品系中华鳖各性状参数比值Tab.2 The ratio of characters and parameters of three strains n=30

2.2 细胞遗传学性状

淮河品系有100张有丝分裂中期相，染色体个数范围为52～68，众数为66的有85张，占有丝分裂中期相的85%；其余10张为减数分裂期，染色体个数在23～35，个数为33的有7张(占减数分裂相的70%)。日本品系拍摄的102张有丝分裂相，染色体个数范围为54～68，众数为66的占82%，16张减数分裂相中，染色体个数为33的有9张(占56%)；黄河品系101张染色体中期分裂相中，众数为66的有88张(占87%)，12张减数分裂相中，个数为33的有8张(占67%)。由此推断3个品系中华鳖均属于二倍体，染色体个数为66，减数分裂期时属于单倍体；此外，均未发现与性别有关的异形染色体。

每组中的同源染色体按总长逐渐减小的顺序排列，3个品系中华鳖染色体中期分裂相及核型图(图2)，中华鳖黄河品系核型公式为2N=16M+10SM+8ST+12T+20MC，臂数NF=92。中华鳖日本品系核型公式为2N=16M+12SM+8ST+16T+14MC，臂数NF=94。中华鳖淮河品系核型公式为2N=4M+8SM+20T+34MC，臂数NF=78。

图2 3个品系中华鳖染色体中期分裂相及核型图a,c,e分别为黄河品系、日本品系及淮河品系中华鳖染色体中期分裂相(×1 000);b,d,f分别为黄河品系、日本品系及淮河品系中华鳖染色体组型(标尺=5 μm)M表示中部着丝点染色体；SM表示亚中部着丝点染色体；ST表示亚端部着丝点染色体；T表示端部着丝点染色体；MC表示微小染色体。Fig.2 The metaphase chromosome division phase and karyotype of three strains of Chinese turtlea, c and e were the metaphase chromosome division phase of the Yellow River strain, the Japanese strain and the Huai River strain (×1 000)；b, d and f were the Yellow River strain, the Japanese strain and the Huai River strain, respectively (scale=5 μm)M represents the centromere chromosome in the middle; SM represents the centromere chromosome in the sub-middle; ST represents the centromere chromosome at the sub-end; T is for centromere chromosomes at the ends; MC is for tiny chromosomes.

2.3 遗传学性状

通过组织特异性的同工酶酶谱筛查，发现3个品系肌肉LDH酶谱均为单态，其他组织其他酶均表现有多态现象，其组织特异性酶谱及遗传结构分析将在另一文中报道。

肌肉中的LDH，观察到6～9个基因座，均由Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C3个基因编码的四聚体酶，分别为A4、A3B、A2B2、AB3、B4、C4、AC3、A2C2和BC3编码。日本品系显示6条清晰的同工酶谱带，黄河品系显示8条清晰的同工酶谱带，淮河品系显示9条清晰的同工酶谱带，除LDH1外，活性均较强。LDH电泳图谱(图3)，均为各自特异性的生化遗传学标记。由于基因表达丰度及相应蛋白大小不同，因此，在迁移率和条带的着色浓度上存在细微差别，显示同种酶在同一物种上因品系不同而具有组织特异性，可以作为鉴别标记之一。

图3 3个品系中华鳖肌肉组织乳酸脱氢酶a～c分别为中华鳖日本品系、黄河品系、淮河品系肌肉组织乳酸脱氢酶1～10分别为各品系中华鳖的1～10个个体。Fig.3 Lactate dehydrogenase (LDH) in muscle tissue of three strains of Chinese turtlea-c respectively shows lactate dehydrogenase (LDH) in muscle tissue of Japanese strain, Yellow River strain and Huai River strain of Chinese turtle1-10 are 1-10 individuals of each strain.

3 讨论

传统的形态学分析方法已经被广泛应用在水产动物的形态特征分析方面，并在不同群体(水系)水生动物的形态特征分析方面得到良好的应用[14-15]。在中华鳖上，刘阳等[16]曾对中华鳖5个不同群体的形态学特征进行主成分分析，发现不同流域中华鳖群体形态差异较大。本研究对3个品系中华鳖的7个性状比值进行分析，能较好反映所测中华鳖的形态性状信息，将可量性状与背甲长相比，反映了中华鳖的体型特征，更好地反映了3个品系之间的形态差异。此外，通过对外形特征进行描述，找到区分点，能直观的初步区分3个品系外部形态特征是种质鉴定的重要方法之一，此法简单直观，但容易受环境条件影响而改变，有一定的局限性[16]。本研究对黄河、日本及淮河3个品系中华鳖成鳖外形特征进行比较分析，结果发现淮河鳖以背甲最宽处为界，背甲后部宽度明显比前部窄许多。体型参数比值体现为：体高/背甲长比值较其他2个品系大，且雌雄差异显著，其机理可能与性别遗传有关。黄河鳖裙边相对较宽，可能受遗传环境的影响。梁宏伟[8]通过框架测量方法，建立判别函数分析形态差异性。而本研究采用传统的测量方法与梁宏伟[8]研究结果一致。两种方法均表明淮河鳖与其他两个品系的形态差异更为明显，相比较而言，黄河鳖与日本鳖的形态特征差异较小。

染色体作为遗传信息的载体具有种(系)的特异性，不同的物种有其特定的染色体组型。核型分析是细胞遗传学研究的重要手段，是从细胞水平认识水生生物种质资源特征的方法，其主要内容是确定种质的染色体数目和组型[14,17]。本研究中，尽管3个品系中华鳖染色体数目在进化上比较保守，二倍体数都是66，但臂数变化较大(NF=78～94)，且核型各不相同，绝对长度与相对长度均有差异，且各自均有其特有的核型。黄河鳖与日本鳖的核型及臂数比较差异不显著(P>0.05)，但黄河鳖ST组染色体较SM组大。淮河鳖核型及臂数，与其他两种鳖相比较差异极显著(P<0.01)，且无亚端部染色体，微小染色体相对较多，可能与遗传本质有关。

淮河鳖染色体臂数NF=78，与黄河鳖及日本品系两者间差异极显著(P<0.01)。淮河品系染色体核型公式：2N=66=4M+8SM+20T+34MC，臂数NF=78；国标中[9]核型公式：2N=66=4M+8SM+16T+38MC，臂数NF=78；两者相比，核型有细微变化，臂数一致，可能因制备方法不同而导致，推测国标[9]所用样本可能是中华鳖淮河品系。中华鳖黄河品系与日本品系核型比较保守，可归纳为2N=66=16M+(10-12)SM+8ST+(12-16)T+(14-20)MC，臂数NF=(92～94)，差异不显著(P>0.05)，推测其亲缘关系较近。

同工酶是分析种质生化遗传标记的经典方法，可从宏观的角度体现孟德尔遗传变化规律[18]。本研究经多种组织多种同工酶酶谱特异性筛查，发现肌肉LDH可作为3个品系中华鳖特有的生化遗传标记。LDH催化乳酸和丙酮酸相互转化并伴随发生辅酶NAD氧化还原反应，存在于生物所有组织细胞中，参与组织的有氧/无氧酵解[19-20]代谢活动，在肌肉中表达丰富。可能因为生物的肌肉活动较频繁，糖的代谢较旺盛。尽管LDH酶的表达与活性存在时间、空间差异性，但其编码基因的表达都能在酶谱上体现，能精准反映物种受基因遗传表达与环境因素调控[13,20]。

LDH为四聚体酶，至少有Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C3个基因编码，比较经典的是由Ldh-A、Ldh-B两个基因编码的5条酶带[21-22]。本研究为从生化标记鉴别3个品系，首先从广谱的酶系对多种组织多个酶谱进行筛选，找到3个品系各自特异性的酶谱——LDH。发现3个品系肌肉LDH均为单态，且有Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C基因编码的大于5条酶带，说明中华鳖3个品系肌肉中LDH的遗传多样性处于中上等地位，可用于区分3个品系的特异性生化标记。

中华鳖属两栖爬行动物，肌肉中多进行无氧酵解，LDH4与LDH5活性较高，富含A亚基，催化丙酮酸转变为乳酸及NAD+，而本研究中除LDH1活性较差外，其他酶带活性均较强，这一结果很好地证明了此理论。尽管3个品系肌肉中LDH表达具有差异性，淮河品系肌肉中LDH酶带更丰富，黄河品系次之，日本品系表达最少，可能是受不同基因位点调控的结果，而受生存环境的影响不大。本研究中还发现3个品系雌雄鳖肌肉LDH的条带数及酶的活性强度之间无明显差别，可能与其进化地位不高有关。这些研究结果表明，同工酶具有组织和品系(种群)特异性，与其生理条件和机能相关[19-20]，受遗传基因表达调控。

通过中华鳖3个品系表型、核型及LDH分析，发现淮河品系差异与其他2个品系差异较大，说明黄河品系与日本品系亲缘关系较近，而与淮河品系亲缘关系较远。为中华鳖品系间杂交育种和亲缘关系研究提供了基础。同时，中华鳖同工酶丰富度反映品质性状，利用该项指标评价中华鳖种质资源，可以挖掘出抗逆性强的优质种质资源。用同工酶指标评价中华鳖品系，筛选生长速度快、适应性强、肉质鲜嫩的品种，兼顾养殖户利益，有利于中华鳖产业可持续发展。

4 结论

通过对3个品系中华鳖的形态特征、生化及细胞遗传学特性研究，发现中华鳖因品系不同，其生物学性状不一致，存在着群体差异性。3个品系中华鳖体细胞染色体数虽都为2N=66，核型公式不一样，臂数NF=(78～94)不一样，且差异显著(P<0.05)，但均未发现性染色体。肌肉组织中乳酸脱氢酶带(LDH)表达量丰富，条数不同(日本品系6条、黄河品系8条、淮河品系9条)，且差异显著(P<0.05)，酶带条数均大于经典的乳酸脱氢酶5条酶带数，由Ldh-A、Ldh-B、Ldh-C3个基因编码，均表现较强活性。本研究可为3个品系中华鳖种质评估、鉴定提供理论参考。