磁共振纳米探针用于阿尔茨海默病的靶向成像诊断

章宏传，翟建

（皖南医学院弋矶山医院医学影像中心，安徽芜湖 241001）

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD） 是一种由神经元变性导致的认知能力下降及行为障碍疾病，是最常见的中枢神经系统退行性疾病之一，也是引起痴呆最主要的原因，占痴呆比例的50%～75%［1－2］。尽管有报告显示高收入国家（欧洲和美国为主） 的AD 发病率下降，但预期寿命的总体增长导致全球患病率依然逐年增加［3］。目前，全世界范围内对于临床诊断的AD 患者依然缺乏行之有效的治疗方法，因此AD 的早期诊断与早期干预治疗对于改善患者预后，延长患者生存期具有重要意义。神经影像在AD 的早期诊断中发挥着越来越大的作用［4］。相比于昂贵的PET－CT 成像，磁共振成像（MRI） 技术凭借无创、无穿透深度限制、无电离辐射、空间分辨率高以及较强的成像灵敏度等优势在AD 的早期诊断中的价值越来越受到人们认可［5］。近年来，纳米技术在医学中的应用飞速发展。纳米探针具有尺寸小、表面积大、易修饰、物理化学性质独特、生物相容性良好、能够在血液循环系统中循环更长时间、有利于穿透血脑屏障 （blood brain barrier，BBB）、显著增加探针在病灶区富集的特点。目前，科研工作者开发了一系列生物毒性低、灵敏度高的MRI 纳米探针，并通过化学修饰策略实现纳米探针对Aβ 多肽和磷酸化Tau 蛋白的高效靶向识别。纳米探针介导的神经影像技术相比于传统AD 影像学手段具有更高的成像灵敏度和特异性，为AD 的早期诊断提供了有力的支持［6－7］。

1 穿过BBB

一般情况下，造影剂是静脉注射的，这意味着从外周血液到大脑组织必须要经过BBB。在AD患者受累脑区中，由淀粉样沉积物包围的血管有缺陷，因此该脑区的BBB 对内源性蛋白具有更高的渗透性［8］。血管性痴呆可影响BBB 通透性，并且越来越多的证据表明AD 和BBB 缺陷一起发生。但是，基于AD 动物模型的不同研究表明BBB 的开放程度具有很大的差异性。因此，成功穿过BBB 依然是AD 早期诊断中的重要前提［9］。在过去的十几年里，人们基于BBB 和纳米探针的特点，开发了诸多通过BBB 的策略和技术，并通过一系列动物模型或临床研究证实了这些策略的可行性。

1.1 经鼻给药绕过BBB 经鼻给药是一种吸收快、起效快、无损伤、非侵入性且易于操作的给药方式［10］。探针可以经嗅黏膜沿着嗅神经束或嗅神经元轴突周围的结缔组织进入脑脊液或脑组织，从而绕开BBB 进入中枢神经系统。但是由于人类嗅黏膜的表面积只占嗅区的5%，因此通过单纯的鼻内给药进入脑组织的探针浓度有时难以满足AD早期特异性诊断的要求。

1.2 侵入性方式通过BBB 破坏BBB 是一种可以直接促进外周循环中的药物进入脑实质的有效方法，破坏的方法主要包括渗透破坏、超声破坏以及电磁脉冲破坏。甘露醇可以使BBB 的血管内皮细胞脱水、皱缩并破坏紧密连接，从而可以用于暂时性地打开BBB，但是打开的效率受许多因素影响，比如甘露醇的浓度、给药速度和时间以及注射后的体内滞留时间等［11］。同时，甘露醇可能带来严重的副作用，如肾功能衰竭、心力衰竭、电解质紊乱以及血容量不足等。微泡在聚焦超声作用刺激下产生的空化效应是无创打开BBB 的另一种有效方式［12］。这种方式不仅高效，而且可以配合聚焦超声焦点位置的改变实现特定部位BBB的打开，同时这种开放效应是可恢复的。此外，人们发现通过调节电磁脉冲的场强和脉冲次数也能实现BBB 的可逆打开［13］。破坏的BBB 保证了更多探针进入脑实质，以满足AD 的特异性成像诊断需求。但是，这种方法也让外周血液中的其他物质（大量水分子、蛋白等） 进入脑组织，从而引起各种副作用，因此在实际应用中应谨慎使用侵入性方式通过BBB。

1.3 被动靶向通过BBB 在AD 等中枢神经系统疾病的发展过程中，正常的BBB 结构会受到不同程度的破坏［9］。因此，具有较长循环时间，脂溶性且粒径在10～100 nm 范围内的纳米探针能够相对容易地在发病部位聚集，但是纳米探针通过该途径在病灶富集的效率相对较低，同时对探针自身的理化性能提出了苛刻要求，增加了探针合成的难度［8］。

1.4 受体介导通过BBB 受体介导胞吞（receptor－mediated transcytosis，RMT） 是内源性大分子（如胰岛素、转铁蛋白等） 通过BBB 的一种重要途径［14］。在BBB 血管内皮细胞表面会高表达一些受体分子，当特异性配体与受体分子结合之后，能诱导胞膜内吞，从而可以将大分子物质转运进入细胞内。用纳米探针修饰靶向配体分子或受体分子特异性抗体，能够明显增加探针穿过BBB 的效率。常用的配体（靶向其对应的受体） 包括转铁蛋白、胰岛素、载脂蛋白E （ApoE）、乳铁蛋白、白蛋白等［15］。此外，还有一类特殊的配体—细胞穿膜多肽 （cell penetrating peptides，CPPs）也被经常用来辅助药物分子通过BBB。CPPs 是由基本氨基酸（一般不超过30 个） 构成的具有细胞穿透能力的短肽，不仅可以将小分子物质运输到细胞内，还能递送大分子（如蛋白、质粒、小干扰RNA、纳米粒子、核酸、脂质体等） 进入细胞。CPPs 的工作机制并不是十分清楚，目前认为这些多肽的穿膜效应主要是由膜蛋白介导的细胞内吞或大胞饮形成的［16］。

1.5 其他通过BBB 的方法 亲脂性小分子（分子量小于500 Da） 可以直接扩散通过BBB。吐温80（一种表面活性剂） 可以增强BBB 血管内皮细胞膜脂类的流动性，导致细胞膜液化［17］。因此采用吐温80 运载药物可以增加药物的BBB 渗透性。BBB 内皮细胞表面的转运载体（如氨基酸转运体、葡萄糖转运体） 也可以协助纳米探针进入中枢神经系统［18］。某些病毒（如狂犬病毒） 具有天然的嗜神经特性，因此可以构建模拟病毒的纳米粒子用于穿透BBB 的中枢系统疾病诊疗［19］。腺苷受体激动剂可以刺激BBB 内皮细胞表面的腺苷受体从而松弛内皮细胞之间的紧密连接实现BBB 的可逆性打开［20］。此外，内源性的炎性细胞具有天然的跨越BBB 的能力，可以将此类细胞作为载体，用于携带诊断或治疗分子进入中枢神经系统［21］。

2 靶向淀粉样斑块

淀粉样斑块是AD 探针的天然靶标，可用于AD 的早期MRI 诊断。目前，至少有3 种可以特异性结合淀粉样斑块的靶向分子，即抗体、多肽（淀粉样多肽或非淀粉样多肽） 和小分子。

2.1 抗体靶向 研究表明修饰了抗Aβ 抗体的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs） 在没有其他手段的帮助下能够成功通过BBB。APP／PS1 转基因AD 模型小鼠的测试结果表明，Aβ 抗体功能化的SPIONs 能够结合Aβ 斑块并增强MRI 检测效果。与常规MRI 平扫检查相比，在功能化SPIONs 介导的MRI 扫描中发现AD 模型小鼠脑区淀粉样沉积物数量增加了2 倍［22］。Viola 等［23］认为Aβ 低聚物相比于淀粉样斑块和Aβ 多肽与AD 的进展关系更为密切，他们将靶向Aβ 低聚物的抗体修饰在磁性纳米颗粒的表面，然后通过鼻内给药的方式，成功在转基因AD 小鼠实现了基于脑部Aβ 低聚物的AD 早期特异性MRI 诊断。中空氧化锰造影剂（hollow manganese oxide nanoparticles，HMON） 整合了锰的顺磁性（Mn3O4） 和高比表面积特性，通过链霉亲和素修饰的HMON 实际上可以结合各种生物素酰化的功能分子，该策略也被用于检测淀粉样斑块［24］。将抗Aβ 抗体功能化修饰的HMON 注入APP／PS1 转基因AD 小鼠脑脊液中，实现了淀粉样沉积物的精确MRI 检测。

2.2 Aβ 多肽靶向 淀粉样斑块的形成源于Aβ 多肽强烈的自聚集倾向。利用 “游离” Aβ 多肽（Aβ1－40） 对现有斑块的高亲和力，可以成功实现含钆（Gd） 元素复合物对斑块进行在体MRI 靶向检测［25］。然而，在这种情况下，探针的BBB 渗透只能通过与甘露醇溶液共注射来实现，产生的副作用会阻碍其临床应用。Aβ1－40 的毒性也逐渐受到人们重视，因此最近的关注点开始转向在N－末端添加了6 个赖氨酸残基的Aβ1－30 多肽。这种K6Aβ1－30 多肽是无毒非纤维性多肽，同时保留了两个主要抗原位点，它被成功结合到含Gd 复合物，在7T 场强下实现了淀粉样斑块的靶向MRI 检测，但需要共注射甘露醇以利于穿过BBB［26］。

按照类似的策略，将Aβ1－40 多肽吸附到葡聚糖包被的单晶氧化铁纳米颗粒（MION） 上。Aβ1－40 功能化的MION 对Aβ1－42 多肽（KD＝ 202 nM） 表现出与游离Aβ1－40 （KD＝266 nM） 相似的亲和力［25］。对APP／PS1 转基因AD 小鼠进行静脉注射Aβ1－40 功能化的MION，可以通过MRI 检测到探针对淀粉样斑块的特异性靶向，而非功能化的MION 没有被检测到。用Aβ1－42 修饰的SPION也能观察到类似的结果。Wadghiri 等［27］报道了用Aβ1－42 多肽功能化的超小SPIONs （USPIONs） 的合成，并用聚乙二醇（PEG） 进一步修饰以增加通过BBB 效率。将USPIONs－PEG－Aβ1－42静脉注射到转基因AD 小鼠（APP／PS1），在没有甘露醇共注射的情况下，可以通过MRI 清晰观察到淀粉样斑块。

2.3 小分子靶向 一些有机小分子具有天然结合淀粉样斑块的能力。Skeby 等［28］研究过多种化合物与淀粉样纤维模型的结合模式，许多化合物都是衍生自可以使淀粉样斑块特异性染色的刚果红或硫磺素T。它们都表现出刚性以及芳香族结构，其他具有苯乙烯基或氨基－萘基的化合物也能够与淀粉样纤维结合，并分别进行了MRI 成像研究。匹兹堡化合物B （PiB） 是硫磺素T 衍生物，其对淀粉样斑块的亲和力已经被人们充分认可。PiB 是研究最多的用于检测淀粉样斑块的配体，在很多临床试验中被用来检测淀粉样斑块［29］。基于Gd－DOTA单酰胺螯合物的造影剂连接了PiB，并进行了水溶液MRI 测试，结果发现T1 弛豫率比常规临床造影剂高约50%［30］。据报道，DDNP （一种二苯丙酮衍生物） 可以通过结合淀粉样纤维中的β－结构域而对淀粉样斑块表现出良好的亲和力。通过配体交换将DDNP 结合到SPION 表面，该探针具有高弛豫率，并且在体外显示出与Aβ1－40纤维显著的结合力。DDNP 磁性纳米颗粒在AD 大鼠模型中也能顺利通过MRI 检测到淀粉样斑块［31］。

姜黄素是一种无毒的黄色色素，不仅能天然结合淀粉样斑块，还能破坏淀粉样蛋白聚集，并穿过BBB。与前面提到的化合物类似，姜黄素是一种具有两个酚环的刚性芳香族分子［32］。虽然一些临床试验表明姜黄素具有治疗痴呆的潜能，但实际的治疗效果仍然需要深入考察。Gd－DTPA 或Gd－DOTA 与姜黄素的功能化探针可以通过MRI 检测到离体小鼠和人脑组织中的淀粉样斑块［33］。Cheng 等［34］的研究中，姜黄素与PEG 一起被吸附到磁性纳米颗粒（Cur－MNPs） 上，然后通过聚乙二醇－聚乳酸 （PEG－PLA） 和聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 稳定颗粒。姜黄素分子主要通过氢键吸附到氧化铁上，并且在转基因AD 小鼠测试中发现纳米颗粒（平均粒径小于100 nm） 能够穿过BBB，离体组织也能在MRI 中明显发现沉积的淀粉样斑块。

据报道，碳水化合物分子如唾液酸也与淀粉样斑块特异性结合。唾液酸是存在于细胞膜中的神经节苷脂GM1 中发现的单糖，GM1 与Aβ 相互作用可能与该疾病的发病有关。唾液酸修饰的SPION 能够在体外和离体小鼠脑中特异性结合Aβ多肽［35］。

3 靶向Tau 蛋白

近年来，由于一系列Aβ 靶向药物的临床试验以失败告终，磷酸化Tau 蛋白作为AD 另一种重要的病理改变越来越受到人们关注［36－37］。浙江大学凌代舜［38］及其合作者开发了一种Tau 蛋白靶向的多功能纳米组装药物，用于AD 的成像诊断与治疗。凌代舜的研究团队首先将具有清除活性氧（ROS） 功能的超小氧化铈纳米颗粒和具有MRI 增强作用的超小氧化铁纳米颗粒修饰在介孔氧化硅的表面，接着修饰能够靶向识别Tau 蛋白的放射性核素标记配体68Ga－NOTA－T807，同时利用介孔氧化硅纳米粒子较大的孔洞体积负载具有抑制Tau聚集作用的药物亚甲蓝，从而设计出一种集靶向、成像与治疗于一体的多功能纳米组装药物。该纳米组装药物能有效结合神经元中过度磷酸化的Tau蛋白，并通过MRI／PET 双模态成像有效实现脑部定位。与此同时，超小氧化铈纳米颗粒可发挥纳米酶功能自动清除ROS，与负载的亚甲蓝协同抑制Tau 蛋白的过度磷酸化和磷酸化Tau 蛋白的聚集。体外及体内实验均证明，该复合多靶点治疗策略具有较好的协同治疗效果，能有效抑制神经元的凋亡，保持神经元的活性。

4 靶向其他

AD 脑区具有特殊的氧化还原微环境，在这样的环境中，金属离子会自动发生生物合成反应［39］。Lai 等［40］通过给予AD 模型小鼠葡萄糖酸锌和FeCl2，利用AD 脑区的特殊微环境，原位合成了氧化锌和氧化铁纳米晶体，同时分别实现了AD 的荧光和磁共振双模态成像诊断。此外，Chen 等［41］构建了一种经鼻多功能纳米递送体系，该体系主要由氯毒素B 亚基（靶向海马区域神经元内的单唾液酸神经节苷脂GM1）、Gd 螯合物（MRI 成像）以及Cy5.5 （模型药物，可用于荧光成像） 组成。经鼻递送该纳米体系可有效避开BBB，同时利用Gd 螯合物的MRI 成像监控能力，最终成功将Cy5.5 递送到海马脑区，为AD 的成像诊断与治疗提供了新的思路。

5 小结

MRI 准确诊断AD 的能力在很大程度上取决于造影剂的性能，因此不断提升纳米探针的成像灵敏度、特异性以及BBB 穿透效率依然是未来研究的重点。而探针的生物毒性会直接限制探针的临床转化，故采用生物友好的原料，经过相对简单的合成步骤得到高生物安全性的纳米探针也是不能忽视的方面。此外，整合成像与治疗的诊疗一体化纳米探针将会受到更多重视，将为AD 的整体管理提供创新的解决方案。总之，我们期待更多性能优良、安全低毒、功能丰富的AD 靶向纳米探针被开发，同时期待此类探针的临床转化发生质的改变。