QuEChERS法萃取-气相色谱-三重四级杆串联质谱法检测大葱等鳞茎类蔬菜中6种杀菌剂的分析方法

刘建平 骆 洪 连海飞 崔 艳 聂 晶

(内蒙古自治区农牧业科学院资源环境与检测技术研究所，呼和浩特 010031)

鳞茎类蔬菜，又称葱蒜类蔬菜，如大葱、大蒜、洋葱等，具有特殊的辛、辣气味，是我们日常生活之中必不可少的菜肴，也是老百姓喜爱的蔬菜之一[1，2]，该类蔬菜不但可以生食、也可以做菜，使用方法诸多，是秋冬之际北方地区主要的蔬菜品种，如大葱在我国种植面积较为广泛，约占全世界总产量的25%左右，仅2017年上半年，我国出口大葱量约为3.27万吨[3-5]；目前，我国大葱播种模式主要采用畦上播种和沟内播种，在种植过程中，大葱等鳞茎类蔬菜易受到紫斑病、葱锈病、菌核病、葱蓟马、种蝇等病虫害的影响，因此在种植栽培时，常施用杀菌剂和杀虫剂用于防治病虫害，如百菌清可湿性粉剂等防治紫斑病、粉锈宁可湿性粉剂等防治葱锈病等[6-8]；人、畜类误食用被杀菌剂或杀虫剂污染的大葱等鳞茎类蔬菜时，会导致痉挛、头晕等，严重时可能导致死亡，如2017年8月山东寿光“毒大葱”事件[9，10]。因此，加强对大葱等鳞茎类蔬菜中百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯等农药残留的监测，保障人们饮食安全，具有重要的意义。QUECHERS提取法是近年来发展起来的农药检测前处理方法，相比较其他方法，具有试剂用量少、操作简单、速度快等特点[11-15]，本实验建立了QUECHERS法提取大葱等鳞茎类蔬菜中百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯农药气相色谱-三重四级杆串联质谱法检测的分析方法。

1 材料和方法

1.1 实验仪器

气相色谱-三重四级杆串联质谱仪：安捷伦7890B型气相色谱仪，配备安捷伦7000C型质谱检测器、自动进样器、柱温箱等(美国安捷伦科技有限公司)；电子分析天平：mettler-Toledo XP 105DR型，规格：十万分之一(瑞士梅特勒托利多科技有限公司)；石英毛细管色谱柱：Agilent HP-5MS型质谱专用柱，规格：30m×0.25 mm，0.25μm(美国安捷伦科技有限公司)；水浴氮气吹干仪：DCY-36YD型(上海那艾仪器科技有限公司)；超声波清洗机：KQ-500TDB型高频数控超声波清洗器(上海星尧科学仪器有限公司)；超纯水净化系统：Milli-Q A10型(美国密理博科技有限公司)。

1.2 实验材料

标准溶液：内标100μg/mL环氧七氯标准溶液(GSB-05-2317-2016)，100μg/mL百菌清标准溶液(GBW(E)082524)，100μg/mL菌核净标准溶液(1ST21015-100M)，100μg/mL粉锈宁标准溶液(GBW(E)082676)，100μg/mL甲霜灵标准溶液(GBW(E)083007)，100μg/mL异菌脲标准溶液(GBW(E)082520)，100μg/mL溴氰菊酯标准溶液(GBW(E)081176)，均购自农业部环境保护科研监测所。

试剂耗材：甲醇、丙酮、乙腈、环己烷均为色谱纯，购自德国默克试剂有限公司；实验用水：纯化水，纯水仪制；C18、N-丙基乙二胺(PSA)，购自天津博纳艾杰尔科技公司；净化包(1g MgSO4, 500mg PSA和500mg C18)，购自浙江合谱试剂公司。

1.3 溶液配制

内标储备液：精密移取1.0mL100μg/mL环氧七氯置于容量瓶中，用丙酮定容摇匀，环氧七氯质量浓度为10μg/mL)。

标准混合储备溶液：精密移取100μg/mL浓度的百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯标准液各1.00mL，置于10mL容量瓶中，加少量丙酮溶解，再用丙酮定容摇匀，百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯质量浓度为10μg/mL。

标准曲线溶液：分别移取上述标准混合储备溶液一定量，加丙酮制备含百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯质量浓度分别为0.04、0.10、0.50、2.00、4.00、10.0μg/mL的系列标准溶液，每个浓度点加入10μg/mL环氧七氯溶液50uL，即得标准曲线溶液。

样品溶液：取鳞茎类蔬菜(以大葱为例)约500 g，切成3cm长小段，置粉碎机中粉碎，粉碎后的样品置密封袋中，冷冻保存；准确称取样品10.0 g，置塑料离心管中，加丙酮-环己烷(V∶V=1∶1)溶液20mL，再加入1.0 g乙酸钠和4.0 g MgSO4(QuEChERS萃取包)，涡旋提取3.0 min后，冷冻离心10 min(12000 r/min)；将离心后的萃取液转移至QuEChERS净化管中(400mg PSA，1.2g MgSO4，400mg GCB和400mg C18)，涡旋混合2.0 min后，冷冻离心10 min(12000 r/min)；取上清液10mL，置氮吹仪上氮吹至近干，残渣加加入10μg/mL环氧七氯溶液50uL，丙酮定容1.0mL，涡旋1min，0.45μm滤膜滤过，即得。

1.4 实验方法

色谱参数：色谱柱：Agilent HP-5MS(30m×0.25 mm，0.25μm)；载气：氦气(纯度：99.9999%)；进样口温度: 230℃；碰撞气：氩气(纯度：99.9999%)；柱流量：1.28 mL/min；进样方式：不分流；进样体积：1μL；升温方式：程序升温。升温程序见表1。

表1 升温条件

质谱参数：开启质谱仪，过夜抽真空，用全氟三丁胺自动调谐仪器至最佳检测条件。调谐后质谱参数见表2。

表2 质谱仪参数

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

现阶段，用于蔬菜中农药残留检测的前处理方法主要有：凝胶净化色谱法、自动固相萃取法和QuEChERS提取法等方法。凝胶净化色谱法采用过凝胶柱方式净化待测样品，提取效果好，但试剂用量较大，且仪器价格昂贵，方法适用性较差；全自动固相萃取法采用固相萃取装置净化、富集、洗脱待测样品，操作步骤繁琐，检测准确度偏低；QuEChERS提取法是近阶段发展起来的前处理方法，具有试剂用量少、提取速度快、步骤简单、检测准确度高等特点。实验通过比较上述3种前处理方法，对加标样品(加标终点浓度：0.1 μg/mL)进行提取，考察3种前处理方法检测准确性。结果见表3。

表3 3种前处理方法比较

2.2 质谱方法(MRM)的优化

三重四级杆串联质谱仪定量检测模式有两种：全扫描模式(SCAN)和多反应监测模式(MRM)。如果采用全扫描模式，则离子响应值较低，不适用鳞茎类蔬菜中极微量农药残留的检测；MRM方法采用离子监测方式，可以大大提高离子响应值，更适用于极微量农药残留的监测，但MRM方法需要进行优化后才可达到预期效果。实验配制浓度为5 μg/mL的百菌清标准溶液，注入三重四极杆串联质谱仪1 μL，采用SCAN模式，找到目标化合物的母离子；再采用碎片离子扫描模式，将母离子击碎，找到母离子对应的子离子；选择响应强度较高的3个子离子，其中1个作为定量离子，2个作为定性离子；根据选择的离子对，进行碰撞能量和碰撞电压的优化，建立百菌清MRM方法；同法建立菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯的MRM方法。离子对选择见表4, 6种农药典型的标准谱图见图1。

表4 6种农药的质谱参数

图1 6种农药的典型标准谱图

2.3 内标法消除干扰

三重四级杆串联质谱法采用离子对监测的方式进行，虽然专属性较好，但在实际检测过程中，常时常受到环境温度等因素变化，导致待测目标农药信号值发生漂移；且鳞茎类蔬菜大多具有辛、辣气味，含有挥发性物质较多，基质较为复杂，待测目标农药可能会受到基质干扰导致信号增强或抑制。为消除上述干扰，提高检测结果准确度，实验采用内标法，即在标准溶液和样品溶液中同时加入内标物环氧七氯，通过内标法校正待测目标农药，提高检测结果准确度。实验比较外标法和内标法对待测目标农药准确度的影响，证明内标法准确度更高。因此实验选择内标法作为定量方法。

2.4 标准曲线、相关系数和检出限

取1.3溶液配制项下标准储备溶液，分别精密移取一定量，加丙酮制备含百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯质量浓度分别为0.04、0.10、0.50、2.00、4.00、10.0μg/mL的系列标准溶液，即得标准曲线溶液；再按1.4实验方法项下色谱和质谱条件设置仪器，上述溶液分别取1 μL注入色谱仪，以待测目标农药质量浓度为横坐标(X)，对应响应值为纵坐标(Y)进行线性拟合，绘制标准曲线，再以3倍信号和噪音的比值计算检出限。结果见表5。

表5 6种农药标准曲线、相关系数和检出限

2.5 方法重复性试验

选取空白鳞茎类蔬菜(以大葱为例)，加入1.3溶液配制项下标准混合储备溶液一定量，制备添加6种待测目标农药终点浓度0.1 μg/mL的加标溶液，同法平行配制6份，再按1.4实验方法项下色谱和质谱条件设置仪器，上述溶液分别取1 μL注入色谱仪，根据检测结果计算重复性RSD。结果百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯重复性RSD分别为3.18%、2.79%、4.12%、3.57%、4.61%和3.94%，6种待测目标农药重复性RSD均不高于5.0%，表明方法重复性良好。

2.6 加标回收试验

选取空白鳞茎类蔬菜(以大葱为例)，分别加入1.3溶液配制项下标准混合储备溶液一定量，制备3个浓度水平(终点浓度：0.02μg/mL、0.20μg/mL和2.0μg/mL)添加6种待测目标农药的加标溶液，每个浓度水平添加3份，再按1.4实验方法项下色谱和质谱条件设置仪器，上述溶液分别取1 μL注入色谱仪，根据检测结果和实际添加量计算回收率试验结果。结果百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯平均加标回收率在84.2～104.2%之间。结果见表6。

表6 回收率试验结果 %

2.7 实际样品的检测

随机购买市售大葱、大蒜、洋葱样品，按1.3溶液配制项下样品溶液制备方法进行前处理，得样品溶液，再按1.4实验方法项下色谱和质谱条件设置仪器，上述样品溶液分别取1 μL注入色谱仪，采集色谱图，计算样品中百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯的含量。结果见表7。

表7 方法应用实例

3 结论

本实验建立了QUECHERS法提取大葱等鳞茎类蔬菜中百菌清、菌核净、粉锈宁、甲霜灵、异菌脲和溴氰菊酯农药气相色谱-三重四级杆串联质谱法检测的分析方法，此方法具有快速、灵敏和准确等优势，且线性关系良好，平均加标回收率在84.2～104.2%之间，重复性相对标准偏差均在5.0%以内，与其他农药残留方法相比较，具有试剂用量少、效率高等特点，可以用于大葱等鳞茎类蔬菜中常用农药的检测。