一种根系分泌物收集装置的研制及在烟草分析中的应用

冯 超 张成省 张家韬 周本国 王卫民 谭效磊 崔志燕

(1.中国农业科学院烟草研究所 烟草行业烟草病虫害监测与综合治理重点实验室，青岛 266101；2.陕西省烟草公司，西安 710000；3.安徽省农科科学院烟草研究所，合肥 230001；4.浙江中烟工业有限责任公司，杭州 310000；5.山东省烟草公司临沂市公司，临沂276000)

根系分泌物是指植物正常生长过程中向外界环境中释放的一系列化学物质，如质子、低分子量有机酸、氨基酸、可溶性蛋白质、可溶性糖、黏胶质、细胞脱落物等[1]。根系分泌物对于植物缓解外界胁迫、促进养分有效性以及土壤与植物之间的物质交流等具有重要作用。在植物生长发育过程中，根系作为植物与土壤的接触部分，不仅从土壤中吸收水分和养分，而且通过根分泌的方式向根周围释放一些无机离子和有机化合物，这些物质统称为根系分泌物[2]。有大量研究表明[3,4]，根系分泌物影响到土壤生物学环境变化和化感作用，不同作物对土壤微生物群落影响不同，同种作物受病原菌侵染后根系分泌物的成分含量不同，从而改变了土壤微生物群落的生长代谢。然而，要了解根系分泌物的功能，必须先得到根系分泌物。

目前，收集植物根系分泌物一般采用溶液收集法，即将生长在营养液或营养土中的根系转入处理溶液中，一段时间后，收集处理溶液即为根系分泌物。这一方法存在的缺点是：生长在营养液或营养土中的植物取出后缺少自然条件选择，无土壤胁迫很难反映土壤条件下根系分泌的实际情况，这是因为土壤成分复杂、养分存在形式多样化[5,6]。因此，寻找一种在自然条件下，土壤胁迫过程中植物根系分泌物的收集方法很重要。为研究无外界干扰根系分泌物的有效表达，不扰动根系生长，不破坏根际环境，监测根际病原菌侵染后根系分泌物的变化具有重要意义。本研究以感染/未感染烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)的小黄金1025为材料，采用试验室自制根系分泌物收集装置获得根系分泌物，并通过LC-MS分析其差异性代谢物。

1 材料和方法

1.1 材料

植物材料：高感烟草疫霉菌品种小黄金1025，由中国农业科学院烟草研究所烟草种质资源库提供。

菌株材料：烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae 0号生理小种，由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究室分离纯化。

药剂：KNO3为分析纯，购自上海化学试剂公司。

仪器：LCMS-Q-TOF高分辨质谱仪(美国Thermo公司)；真空冷冻干燥机(德国Christ公司)。

栽培基质：灭菌土壤、草炭和珍珠岩(V/V/V=2∶2∶1)。

根系分泌物收集装置(图1)：以小黄金1025根系分泌物为例，说明根系分泌物收集装置的操作方法。一种根系分泌物发生及收集装置由植物生长器(图1 a)，根系生长引导装置(图1 b、图1c)，根系洗脱及分泌物收集装置(图1 d)(下简称收集装置)组成，根系生长引导装置由网状结构(图1 b)和塑料隔板(图1 c)组成。具体操作步骤为：将根系生长引导装置装入植物生长器中，高温灭菌(120℃，20min)后，将灭菌营养土倒入植物生长器中，预先培育好的小黄金1025定植于营养土中，根据烟株大小确定定植数目。将整个装置放入人工气候室培养。在重力作用下，植物根系向下生长，穿过根系生长引导装置。20～30d后待植物根系到达网状结构，取下塑料隔板，链接收集装置，内置石英沙等，用铝箔纸包裹收集装置。待小黄金1025根系在收集装置中积聚一定量后，将石英沙去除，收集装置灭菌后装入无菌水，收集根系分泌物。

图1 根系分泌物发生及收集装置

1.2 方法

1.2.1灭菌处理

种子消毒：将烟草种子装入灭菌纱布中，放入10% H2O2液中消毒10 min后取出，用无菌水冲洗5 次，每次1min即可获得无毒种子[7-9]。

栽培基质消毒：高温灭菌120℃，30min。

收集装置消毒：高温灭菌120℃，20min。

1.2.2游动孢子悬浮液制备[10]

将供试烟草疫霉菌置于28℃、12 h光暗交替的恒温光照培养箱中培养10～14d，待大量产孢后，在培养皿中加入灭菌0.1%KNO3溶液(刚好没过菌丝)。随后将培养皿置于4℃冰箱20 min，再转至 25 ℃光照培养箱中放置 25 min，诱导孢子囊释放游动孢子，镜检，吸出悬浮液并用血球计数板观测浓度，稀释为106孢子/mL 的游动孢子悬浮液。

1.2.3植物材料的培育及试验处理

将消毒后的烟草种子直接播种于沙土中萌发。待20d后获得幼苗，选取大小一致的幼苗转移到假植盘中，采用常规栽培方法待幼苗长至4叶期时移栽到1.1中所述的植物生长器中。每个植物生长器中种植2行，每行6株烟草。放于人工气候室，条件为白天30℃，晚25℃，连续培养。试验设2个处理，处理1为感染组，即感染烟草疫霉菌的小黄金1025根系分泌物收集：根系分泌物收集前3d在烟株根部注射烟草疫霉菌孢子悬浮液，每株接烟草疫霉菌孢子悬浮液500μL；处理2为未感染组，即未感染烟草疫霉菌的小黄金1025根系分泌物收集：即为常规培养。每个试验处理设6次重复。

1.2.4根系分泌物的收集

植物生长器中的小黄金1025连续培养8周后。其根系在收集装置中积聚一定量，将石英沙去除，收集装置灭菌后装入无菌水继续培养24h，收集根系分泌物。将收集液过滤(滤膜孔径：0.22um，尺寸：φ25mm)，滤液冷冻干燥。称量所有根系鲜重，用灭菌去离子水溶解根系分泌物冻干物，定容至每毫升根系分泌物母液为1克根分泌而成，即1g根分泌/mL。-20℃保存备用。

1.2.5根系分泌物的LC-MS分析

定容后的根系分泌物利用LC-MS进行成分分析。本实验的仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS(Thermo, Ultimate 3000 LC, Orbitrap Elite)，分离色谱柱为C18色谱柱(Hypergod C18(100×4.6mm 3μm))。

色谱条件：柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；流动相组成A：水+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸。进样量为4μL，自动进样器温度4 ℃。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI源)，同时采用正、负两种离子化模式检测：正模式，离子源温度300 °C，鞘气，45arb，辅助气，15 arb吹扫气，1arb，喷雾电压，3.0KV毛细管温度，350 °C，碰撞诱导解离能量为30%；负模式，离子源温度300 °C，鞘气，45arb，辅助气，15 arb吹扫气，1arb，喷雾电压，3.2KV毛细管温度，350 °C，碰撞诱导解离能量为60%。

数据处理：应用SIVE软件(Thermo公司)对LC/MS数据进行预处理及归一化，并在Excel2007软件中进行编辑，将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件(版本13.0)进行主成分分析(PCA)。

2 结果与分析

2.1 烟草根系在收集装置中的生长情况

烟草植株在植物生长器内定植20～30d后，根系充分分散在生长器内，在重力作用下，烟草根系向下生长，20d后根系通过固体培养基到达根系生长引导装置的网状结构，取下塑料隔板，链接上收集装置。在收集装置中装满石英沙等，用铝箔纸包裹收集装置。8周后取下铝箔纸发现，烟草根系完全分散于收集装置中，且生长良好，积聚一定量，将石英沙去除，收集装置灭菌后装入无菌水，根系分散在无菌水中，1d后收集根系分泌物。

2.2 感染/未感染组成分分析

为获得感染/未感染组根系分泌物的代谢物信息，采用多元统计分析，即PLS-DA和OPLS-DA分析[11]，最终获得差异性代谢物。

2.2.1PLS-DA分析[12]

采用监督性的多维统计方法即偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)对两组样本进行分析，并使用得分图进行可视化(图2、图3)，图中每一个点代表一个样本，两个处理组均未观察到离群值；感染组和未感染组样本可以通过主成份t[1]分开，说明两组根系分泌物样本在代谢物方面具有较为明显差异；图中两组样本间有一定的存在距离，同样说明两组样本的代谢物存在变化。判别模型质量好坏的主要参数为R2Y及Q2值，本模型正模式下R2Y=0.983，Q2=0.929；负模式下R2Y=0.992，Q2=0.964。正模式下和负模式下两者均趋于1，表明该模型能够真实反映样本状态。另外我们对模型进行排序验证，检验模型是否“过拟合”，从图4和图5可见，模型未出现“过拟合”。因此，该模型对于解释两组之间差异及寻找差异物质是可靠的。

图2 正模式感染组(X)未感染组(CKX)PLS-DA得分图

图3 负模式感染组(X)未感染组(CKX)PLS-DA得分图

图4 正模式PLS-DA下排序验证图

图5 负模式PLS-DA下排序验证图

2.2.2OPLS-DA分析

进一步使用OPLS-DA进行建模分析并使用得分图进行可视化(图6,图7)，由图可见未发现各组存在离群值。t[1]将感染组和未感染组明显分开，这种明显的分离趋势说明两组根系分泌物在代谢物方面具有明显差异。结果表明在正模式下得到4个主成分和1个正交成分，R2X=0.9，R2Y=0.997，Q2=0.945；负模式下得到2个主成分和1个正交成分，R2X=0.73，R2Y=1，Q2=0.984。表明建立数学模型较可靠。

图6 正模式感染组(X)未感染组(CKX)OPLS-DA得分图

图7 负模式感染组(X)未感染组(CKX)OPLS-DA得分图

2.2.4感染/未感染组之间差异性代谢产物的筛选和鉴定

使用2.2.3构建的OPLS-DA模型计算根系分泌物样本中各变量的VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1)，并结合t-test的p值(p<0.05)，分别筛选鉴定正负模式下差异性表达代谢物。差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(http://metlin.scripps.edu/)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass)。差异性代谢物数据如表1、表2所示。

表1 正模式下未感染/感染根系分泌物差异性代谢物

表2 负模式下未感染/感染根系分泌物差异性代谢物

在健康小黄金1025接种烟草疫霉菌后，根系分泌物代谢物单体含量发生变化。主要为有机酸、碱、烯、醇、酯、酮、醛、胺等物质。未感染组和感染组相比，根系分泌物化合物单体Fold change值呈负数时表明感染组含量升高，正数时表明感染组含量下降。Fold change值为未感染组与感染组均值之比以2为底对数值，其绝对值为3时，表明均值比为8。若绝对值大于3表明均值比大于8，即变化为8倍以上，被认为含量有较大变化，可作为研究对象继续研究。共发现17种差异显著的物质，分别是：正模式下三丙酸甘油酯(Glycerine tripropionate，-8.5511)、9-芴醇(9-Fluorenol，-5.8092)、荷哈默辛(Horhammericine，-4.1023)、肉桂酸异戊酯(Isoamyl cinnamate)，-3.3714)、4-正庚氧基苯甲酸(4-Heptyloxybenzoic acid，-3.2930)、蓖麻烯(Casbene，7.0232)；负模式下，茉莉酮(Prohydrojasmon，-11.5744)、野罂粟碱(Nudicauline，-8.1470)、对香豆酰基荧光素(p-Coumaroylagmatine，-6.6767)、石蒜碱(Lycaconitine，-5.3806)、维生素C(Acoric acid，-3.7204)、4-羟苯丙酮酸(4-Hydroxyphenylpyruvic acid，7.2620)、油酸(Oleic Acid，6.3313)、4-羟基苯乙醛(4-Hydroxyphenylacetaldehyde，5.6158)、海绵碱(Caaverine，4.4791)、肉桂酸(ferulic acid，3.4298)、二硝托胺(Dinitolmide，3.2196)。

在两种模式下，绝大多数单体物质Fold change值呈负数，说明感染组含量升高，即接种烟草疫霉菌后大部分代谢物单体含量升高，分析原因可能与侵染后寄主植物产生的抗体物质，或是侵染后烟草疫霉菌孢子萌发时产生的代谢物质有关，这部分物质是否诱发病害发生还需进一步研究。部分代谢物单体Fold change值呈正数，说明感染组含量降低，分析原因可能与烟草疫霉菌生理过程中能量消耗有关。

3 讨论

研制了一种在自然条件下，不扰动根系生长、不破坏根际环境、土壤胁迫过程中植物根系分泌物的收集装置及方法，可实现无外界干扰单一病原菌侵染后，根系分泌物的有效表达，监测根际病原菌侵染后根系分泌物的变化。克服现有方法中根系易腐烂、易受微生物污染、取样易伤害根系、不能连续取样等弊端。

烟草品种小黄金1025是对烟草疫霉菌高感品种，在生产上常用作鉴定抗感品种的感病对照。接种烟草疫霉菌后，伴随着疫霉菌对小黄金1025的侵染过程，其根系分泌物发生变化，为获得这一变化结果，采用试验室自制装置收集到感染组和未感染组根系分泌物样本，并采用LC-MS方法获得了代谢物变化。

在烟草疫霉菌侵染后，未感染组和感染组表现出不同的代谢特征。接种烟草疫霉菌后，病原菌与寄主植物烟草小黄金1025发生相互识别，识别发生在互作的最早阶段，有启动或引发寄主和病原物一系列病理反应的功能。病原物对寄主植物周围的根部作出反应到侵染，仍需要一段较长的时间[13]，在此期间根部微生物群落发生变化，造成根系分泌物代谢物发生变化。大量研究证实，土壤病原菌对寄主植物根部的定殖被认为与寄主植物的根系分泌物有关[14]。病原微生物对根系分泌物具有趋向性，致使其逐渐在根际和根表群集[15]。根系分泌物中含有大量与微生物定殖有关的糖类、氨基酸、有机酸以及其它化学物质。分泌物成分因植物品种、生理状态、发育时期、病原菌的侵染而不同，分泌物的成分导致根系周围微生物群落差异，进而影响根系周围微生物种群的生物活性和病原微生物的定殖过程[16,17]。Rudrappa[18]等研究表明，在拟南芥-青枯病害系统中，病原物侵染后，根围苹果酸分泌物显著增加。苹果酸分泌物能吸引有益枯草芽孢杆菌在根系周围定殖，组成生物膜保护根系受到病原物的进一步侵染。该研究证明了根系分泌物对植物和不同微生物互作有重要作用。Deacon等[19]研究表明根系分泌物影响病原菌和寄主互作的早期识别过程，寄生疫霉侵染寄主植物后，寄生疫霉游动孢子可以被氨基酸(特别是谷氨酸和天冬氨酸)、有机酸、糖类、次生代谢物和挥发物吸引。

综上所述，烟草根系分泌物种类复杂，收集和分离过程差异较大，利用有机溶剂提取只能获取其中一部分，有机溶剂还将影响鉴定结果，因此研究一种适合烟草根系分泌物的收集装置及方法尤为重要。LC-MS分析结果表明烟草小黄金1025根系分泌物的主要提取物有烃类、苯、噻唑、酸、酮、酰胺、酯、醇和酚，在感染疫霉菌后，代谢物含量发生较大变化。为后期研究根系分泌物与疫霉菌互作识别提供重要的理论依据。