顺铂和20(R)-人参皂苷Rg3的HPLC分析和双载药缓释抗癌药物制备研究

陈定宁 许 雯 沈昊宇

(1.浙大宁波理工学院，宁波315100; 2.浙江大学校医院内科，杭州 310027; 3.浙江大学化学工程与生物工程学院，杭州 310027)

研究发现，癌症已成为世界上影响人类健康的重要疾病，化学疗法是癌症治疗中最常用的方法之一[1，2]。化疗药物普遍存在水溶性差、生物膜渗透率低、缺乏分子靶向性等缺陷使得此类药物在体内的代谢效果不佳，对人体产生一系列的不良反应从而造成不可逆转的伤害。因此构建一种新型的靶向性药物传递系统，使药物浓集于病灶达到增加疗效、降低药物毒副作用的目的，已经成为抗癌药物研发的热点[3]。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是由两种单体即乳酸(LA)和羟基乙酸(GA)按不同比例缩聚而成的一种可降解的高分子线性聚合物，如PLGA 80:20(80% LA和20% GA组成)，PLGA 75:25，PLGA 50:50[4]。PLGA因具有良好的生物兼容性、可降解性、合成简单、稳定性高、降解速度可调节及可塑性好等特点，现已广泛应用于临床医学领域[5-7]。

大量药理实验数据表明[8-10]，顺铂(CDDP)和20(R)-人参皂苷Rg3(Rg3)在癌症治疗具有显著作用。为进一步提高CDDP和Rg3的生物利用率和临床疗效，本研究以PLGA为基底材料，同时包埋CDDP和Rg3制备得PLGA-CDDP/Rg3纳米粒，并建立缓释药物的高效液相色谱检测方法研究其缓释效果。该方法检出限低，分析速度快，精密度好，仪器性价比高，适用于该双载药系统的研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪(Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific)，带有紫外检测器；电子天平；水浴锅；细胞粉碎机；冷冻干燥机。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物；顺铂；20(R)-人参皂苷Rg3；甲醇；乙腈；二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)；氯化钠; N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；聚乙烯醇(PVA)

1.2 PLGA-CDDP/Rg3的制备

取一定量CDDP和Rg3分散于PLGA的DMF溶液中，超声至粉末完全溶解形成W/O初级乳液。将初级乳液滴加至15mL 1% PVA(w/v)水溶液中，超声混匀形成W/O/W乳液。然后缓慢滴加等体积2%(w/v)异丙醇溶液，室温下搅拌3 h直至有机相完全挥发。收集的微球用少量去离子水洗涤并冷冻干燥，即得到PLGA-CDDP/Rg3纳米粒，4℃保存备用。

按上述步骤制备不含CDDP和Rg3的PLGA纳米粒作为辅料对照。

1.3 实验方法

1.3.1溶液的制备

(1)标准储备液

CDDP标准储备液：精密称取CDDP标准品50 mg于烧杯中，加入质量分数为0.9%的NaCl溶液溶解，转移至50 mL容量瓶并加0.9% NaCl溶液稀释至刻度，制成1000 mg/L的标准储备液。

Rg3标准储备液：精密称取Rg3标准品50 mg置烧杯中，用少量甲醇溶解后加水混合均匀，转移至50 mL容量瓶中并加水稀释至刻度，制成1000 mg/L的标准储备液。

(2)样品溶液

样品溶液1(CDDP)：精密称取PLGA-CDDP/Rg3纳米粒10 mg于烧杯中，加入质量分数为0.9%的NaCl溶液溶解，转移至100 mL容量瓶并加0.9% NaCl溶液稀释至刻度，制成100 mg/L的样品溶液1。

样品溶液2(Rg3)：精密称取PLGA-CDDP/Rg3纳米粒10 mg于烧杯中，加入去离子水溶解，转移至100 mL容量瓶并加去离子水稀释至刻度，制成100 mg/L的样品溶液2。

(3)空白辅料溶液

精密称取适量PLGA纳米粒，按“1.3.1(2)”项下方法进行操作，制成空白辅料溶液。

1.3.2顺铂柱前衍生化方法

取0.5 g DDTC溶于0.1 mol/L NaOH溶液中，配制成5%的DDTC溶液(每次需新鲜配制)。

将500 μL已知浓度的CDDP溶液和50 μL 5% DDTC溶液在37℃水浴中避光混合30 min，制得Pt(DDTC)2(经三氯甲烷萃取后进HPLC分析)。。

1.3.3色谱条件

顺铂：Welch welchrom C18(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(70∶30，V∶V)；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL。

人参皂苷Rg3：Welch welchrom C18(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(45∶55，V∶V)；检测波长：203 nm；柱温：30℃；流速：1 mL/min；进样量：20 μL。

2 结果

2.1 专属性考察

精密量取一定浓度的标准储备液、样品溶液和空白辅料溶液20 μL(CDDP按“1.3.2”方法进行预处理，下文均进行此处理)，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。由图1可知，辅料不干扰样品测定，专属性较高。

图1 HPLC色谱图

2.2 线性关系考察

取CDDP和Rg3标准储备液适量，分别稀释制成0.1～50 mg/L和0.5～50 mg/L系列溶液。以衍生化产物Pt(DDTC)2和Rg3峰面积与药物浓度进行线性回归，回归方程为y=0.8598x-0.3859(R2=0.9993)，y=0.0916x-0.0218(R2=0.9997)。最低检测限分别为0.0459和0.0365 mg/L，见图2。

图2 CDDP和Rg3标准曲线

2.3 纳米球的载药率及包封率

CDDP和Rg3以固体的形式包裹于PLGA，需将药物全部溶出，再测定其含量。故取10 mg冷冻干燥后的纳米粒于10 mL溶剂中，避光条件下超声1 h，按相应方法测峰面积，根据回归方程计算CDDP和Rg3的含量，并计算载药率和包封率，结果如表1所示。

表1 PLGA-CDDP/Rg3纳米粒的包封率和载药率

2.4 纳米球的体外释放测试

准确称取一定量CDDP、Rg3和PLGA-CDDP/Rg3纳米粒分散于相应溶剂中，在避光条件下，每隔一段时间取出一定量溶液，并替换新鲜等量的溶剂。分别按上述方法进行柱前衍生和直接进样，计算CDDP和Rg3释放量。如图3所示，相比较于CDDP和Rg3直接分散于溶剂，包裹PLGA后的纳米粒缓释效果明显。在48 h和24 h时，CDDP和Rg3的释放量分别达到顶峰85.07%和78.18%，体现了缓释微球的良好的缓释性能。

图3 CDDP和Rg3体外累计释放曲线

2.5 精密度考察

取低、中、高浓度(0.5、10.0、50.0 mg/L)的CDDP和Rg3标准溶液，进样6次，分别计算CDDP和Rg3峰面积的RSD值为0.32%、0.13%、0.56%和0.37%、0.05%、0.78%，可见精密度良好。

2.6 加标回收考察

称取CDDP和Rg3已测定的缓释粉末各9份，置于30 mL螺口瓶中，按照CDDP和Rg3含有量50%、100%、150%加入标准品，每组各3份，HPLC测定CDDP和Rg3总含量，计算得平均加标回收率为99.09%和101.59%，RSD值为1.78%和1.32%。

3 讨论

CDDP和Rg3虽被广泛用于癌症治疗，但因其低水溶性和生物相容性差等缺点而限制了其应用。在低水溶性的抗癌药物上修饰高分子聚合物，可以极大地增强其水溶性和分子靶向性能力，同时达到缓释作用。虽然医药输送体系已经在医学研究上得到广泛应用，但现在大多数研究都只是建立单个药物的输送体系，临床应用中多种药物联合治疗的方式更为普遍。因此联用不同药学机制的药物研发出多重药物输送体系，可在疾病治疗中发挥更好的作用。

本研究采用制备工艺简单、容易实现规模化生产的微囊化技术制备CDDP、Rg3双药联合缓释药物和对缓释效果进行研究。结果显示，该缓释药物的对CDDP和Rg3平均包封率为85.82% ± 3.47%、91.36% ± 5.21%，载药率为70.18% ± 0.97%、67.59% ± 2.64%。并且在体外具有明显地缓释特征，分别在48 h和24 h内CDDP和Rg3的累积释放率达85.07%和78.18%。利用该技术制备的微球/微囊、纳米粒/纳米囊是一种有效的药物缓释手段，可提高口服药物的活性和生物利用度，通过非胃肠道给药明显延长药效，富集于靶器官和组织，降低全身毒副作用，对新药研制开发具有重大应用前景。

在缓释研究方面，本实验采用HPLC法检测CDDP和Rg3的含量，分别在254nm和203nm处可检测到相应的吸收峰，检出限在0.0459～0.0365 mg/L之间，精密度RSD均低于0.78%。且该方法简单便捷，灵敏度高，对药物中的CDDP和Rg3的含量检测具有重要意义。