电针对膜迷路积水豚鼠耳蜗积水程度及血管纹细胞超微结构的影响

蒋丽元 史莹莺 叶恬恬 杨俊文

梅尼埃病（Meniere's disease，MD）是一种临床常见的内耳疾病。MD 好发于40～50 岁中年人，以发作性眩晕、波动性感音神经性听力下降、耳鸣、耳闷胀感伴恶心、呕吐为典型的临床表现[1]。电针治疗MD 能疏通耳部气血，改善前庭及内耳功能，缓解眩晕、耳鸣症状[2]。笔者在前期工作中证实电针百会、听宫穴能显著减轻耳源性眩晕豚鼠膜迷路积水，改善耳蜗听功能[3]，与电针治疗MD 的临床效果一致。MD 的病理基础是膜迷路积水[4]。位于耳蜗蜗管外侧壁的血管纹细胞是产生内淋巴液、维持耳蜗内淋巴液离子成分平衡及特殊电化学特征的关键部位[5]。有研究者通过透射电镜观察发现，经皮下注射血管加压素（arginine vasopressin，AVP）处理后的大鼠耳蜗血管纹细胞内空泡形成，血管纹间隙增大，因此推测AVP 与表达于血管纹细胞顶侧膜的血管加压素受体2（vasopressin type 2 receptor，V2R）结合，引起邻近外淋巴腔隙一侧的血管纹细胞底侧膜表面水通道蛋白2（aquaporin2，AQP2）表达水平增加或构型改变，水通道开放，外淋巴液通过血管纹流向内淋巴间隙，引起血管纹细胞水肿、血管纹间隙增大，内淋巴液增多，最终发生膜迷路积水[6]。本研究旨在观察电针对膜迷路积水模型豚鼠耳蜗积水程度及血管纹细胞超微结构的影响，探讨电针对梅尼埃病膜迷路积水的干预作用及可能的调节机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 选用清洁级雄性白毛红目豚鼠39 只，体重350～400 g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供[使用SYXK（浙）2013-0184]。实验中对动物的所有处置均符合2006 年国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。将39 只豚鼠按随机数字表法分为电针组、模型组、空白组，每组13 只。3 组分别取8 只豚鼠行HE 染色法光镜观察耳蜗积水程度，另5 只行透射电子显微镜观察耳蜗血管纹细胞超微结构。

1.2 主要试剂与仪器 醋酸去氨加压素（海南中和制药股份有限公司，批号：20170701，规格1 ml∶4 μg）；透射电子显微镜（日本Hitachi 公司，H-7650 型）。

1.3 豚鼠膜迷路积水模型的建立与评价 电针组与模型组采用腹腔注射醋酸去氨加压素建立膜迷路积水模型[7]：先按4 μg/（kg·d）给予腹腔注射，连续7 d，第8 天将剂量加大为6 μg/（kg·d），连续3 d，共10 d，第11 天起开始干预。模型评价以耳蜗病理观察为准[8]。

1.4 干预方法 电针组豚鼠固定后，于百会穴向前平刺2 mm，一侧听宫穴直刺3 mm，针刺后接HANS-100A型镇痛电针仪连接两穴毫针；调节刺激参数为：输出电流1 mA，波形为100 Hz 连续波，电针持续刺激20 min，1 次/ d，连续干预10 d；对侧听宫穴不做任何处理。模型组豚鼠仅予相同方法固定。豚鼠百会、听宫穴定位均采用动物比较解剖取穴方法，参照《实验针灸学》[9]中的描述，于动物颅顶骨正中处选取百会穴，于侧面部耳屏正前方凹陷处选取听宫穴。空白组豚鼠不作干预。

1.5 观察指标

1.5.1 一般行为学观察 观察各组豚鼠一般行为学变化，包括豚鼠的精神状态、毛发、步态、进食、体重变化、自发活动情况、耳郭反应等一般情况。

1.5.2 耳蜗积水程度检测 实验第21 天，3 组豚鼠腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg），麻醉后快速打开胸腔，充分暴露心脏，4%多聚甲醛（pH=7.2）灌注至豚鼠身体僵硬发白，断头后剥离附着的肌肉软组织，取出并打开观察侧听泡，暴露耳蜗组织后，置于4%多聚甲醛中固定，过夜后再置于10%乙二胺四乙酸（pH=7.4）中，室温下脱钙约3 周，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。沿耳蜗蜗轴中央平面切片，厚约4.5 μm，HE 染色，光镜下观察耳蜗积水程度。运用Imagepro-plus 系统测量耳蜗中轴两侧第二转蜗管横截面积及前庭阶横截面积，计算蜗管横截面积/（蜗管横截面积+前庭阶横截面积）比值（R 值），两侧取平均值。

1.5.3 耳蜗血管纹细胞超微结构观察 3 组豚鼠麻醉后快速断头，取出观察侧听泡，迅速放入预冷（4 ℃）的2.5%戊二醛固定液（pH=7.4）中，打开听泡，暴露耳蜗组织，用1 ml 注射器吸取固定液自前庭窗孔灌入，耳蜗灌流数次后，置于固定液中（容积约为组织体积的10 倍左右），放入4 ℃冰箱中固定2 d。为排除各组取材与固定时间差异对组织超微结构的影响，实验过程中取材迅速，并确保动物麻醉至耳蜗灌流结束所用时间基本一致。固定结束后，继续放入4 °C 冰箱内脱钙约4 周，经后固定、梯度脱水、浸透包埋、聚合后，超薄切片机半薄切片，厚约1～2 μm，甲苯胺蓝染色后于显微镜下定位。钻石刀超薄切片，厚约70～80 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色液染色，用H-7650 透射电镜观察耳蜗血管纹细胞超微结构并拍摄照片。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组豚鼠一般行为学观察 适应性喂养期间，3 组豚鼠均精神状态良好，耳郭反应灵敏。经造模后，电针组和模型组豚鼠普遍出现精神萎靡，轻微脱毛，步态迟缓，进食减少，体重增长缓慢甚至出现下降，活动减少，耳郭反应迟钝。经电针干预后，电针组豚鼠精神状况及耳郭反应灵敏度与模型组比较均有所改善，但电针组豚鼠皮毛光亮程度、饮食、体重、自发活动情况与模型组比较无差别。

2.2 3 组豚鼠耳蜗积水程度比较 电针组R 值为0.32±0.05，模型组为0.48±0.06，空白组为0.28±0.03，3组比较差异有统计学意义（P＜0.01），模型组高于电针组和空白组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。空白组豚鼠均未出现膜迷路积水，前庭阶、鼓阶、蜗管结构无异常；模型组出现膜迷路积水，表现为前庭膜向前庭阶方向不同程度的隆起扩张；电针组前庭膜隆起程度较模型组减轻，见图1（插页）。

2.3 3 组豚鼠耳蜗血管纹细胞超微结构观察 电针组血管纹细胞胞核清晰可见，胞质与细胞器电子密度不均程度较模型组减轻，细胞水肿程度较模型组减轻，线粒体空泡化变性及肿胀程度明显改善，见图2a（插页）。模型组血管纹细胞胞核可见，胞浆与细胞器电子密度不均，较空白组增高，细胞器受损，结构显示不清，大部分线粒体肿胀，出现空泡化变性，细胞内线粒体嵴出现断裂甚至消失，见图2b（插页）。空白组血管纹细胞核可见，胞浆与细胞器电子密度均匀，线粒体内嵴结构清晰可见；细胞间血管内皮细胞及线粒体、基膜结构显示正常，见图2c（插页）。

3 讨论

中医学中无MD 具体病名的记载，现多将由MD 引起的眩晕归入“耳源性眩晕”范畴。现代医家总结前人经验，认为中医对耳源性眩晕病机的认识无外乎虚实两端，其基本病理性质为本虚标实。因此临床对该病的治疗多以补益为主。《灵枢·海论》记载：“髓海不足，则脑转耳鸣”，故临床治疗眩晕首选与脑髓有关的穴位。百会归属督脉，具有补益脑髓、平肝熄风、开窍、止眩的功效，为治眩晕要穴；MD 病位在耳，听宫内通心、脑及肝胆之气，针刺听宫可疏利肝胆之气，宣通耳窍，多用于内耳疾病的治疗。临床上常以百会配伍听宫治疗内耳眩晕症[10-12]。本研究结果显示，电针刺百会、听宫穴能显著减轻膜迷路积水模型豚鼠的耳蜗积水程度，与课题组前期研究结果相符[13-14]。

内淋巴纵流学说与辐流学说是解释膜迷路容量调节的两种经典理论[15-16]。纵流学说认为内淋巴液主要在耳蜗内血管纹组织分泌产生，最终在内淋巴囊中被吸收代谢；辐流学说则认为内淋巴液产生和吸收均是在耳蜗局部进行，血管纹是产生和吸收内淋巴液的重要部位之一。这两种理论均充分肯定了耳蜗膜性蜗管外侧壁的血管纹在内淋巴液体容量调节过程中的关键作用。耳蜗膜性蜗管外侧壁的血管纹为富含毛细血管网的复层上皮，主要由3 层上皮细胞构成，包括由内侧（靠近蜗管内淋巴腔隙一端）向外侧（靠近螺旋韧带一端）依次分布的边缘细胞，中间细胞以及基底细胞。各细胞以紧密连接的方式相互联系，使血管纹处于相对独立的状态。耳蜗血管纹是AVP 依赖性调节的靶组织之一。有文献报道，血管纹组织中，注射AVP 可通过AVP- AQP2 系统使血管纹细胞底侧膜表面的AQP2 表达水平升高，水通道开放程度增加，外淋巴液水流部分快速流向血管纹；透射电镜下可观察到血管纹细胞内空泡形成，血管纹间隙增大；而在注射AVP 前1 h 预先使用V2R 竞争性阻滞剂（OPC-31260），则能逆转血管纹细胞超微结构的变化[17]。Hideaki 等[18]亦发现，注射AVP 可使大鼠耳蜗血管纹细胞超微结构发生改变，主要表现为细胞空泡化变性，细胞器消失。本实验中，透射电镜观察结果显示，经AVP 注射处理的豚鼠血管纹细胞胞浆与细胞器电子密度不均，电子密度增高，细胞器受损，结构显示不清，大部分线粒体肿胀，出现空泡化变性，细胞内线粒体嵴断裂甚至消失，与文献报道结果相似[18]。电针可使细胞水肿程度减轻，线粒体空泡化变性及肿胀程度明显改善。既往的研究证实，电针具有保护细胞内线粒体结构形态，维持线粒体及细胞正常功能的作用[19]，与本研究结果相符合。电针客观改善了膜迷路积水模型豚鼠耳蜗血管纹细胞的超微结构病理状态，耳蜗血管纹细胞超微结构的改善可能与膜迷路积水的减轻，前庭膜结构的恢复有一定的关系。电针可能通过减轻血管纹细胞水肿及线粒体肿胀、空泡化变性程度，改善细胞缺氧状态，恢复细胞内离子功能，离子流动使细胞浆膜渗透压恢复正常，局部水通道蛋白表达得到调控，水转运功能恢复正常，从而使膜迷路积水程度减轻。电针对膜迷路积水的减轻与对细胞形态、功能的改善形成良性循环，两者相互促进，使内耳内环境达到稳定状态。

综上所述，电针百会、听宫穴治疗能减轻豚鼠膜迷路积水程度，改善血管纹细胞超微结构的病理状态，对血管纹细胞超微结构的改善可能是穴位电针干预膜迷路积水的作用机制之一。