CK- pan 免疫组织化学染色联合弹力纤维染色时不同孵育方法对染色结果的影响

叶恩如 王教辰 翁寿向 郑海红

第八版国际肺癌TNM 分期标准，肿瘤最大径≤3 cm，周围包绕肺组织及脏层胸膜，支气管镜检查显示肿瘤侵及叶支气管，未侵及主支气管为T1；肿瘤最大径≤3 cm，凡是侵及脏层胸膜即为T2。TNM 分期与患者预后密切相关。目前认为脏层胸膜由以下4 层构成：间皮细胞层、间皮下结缔组织层、弹力纤维层以及结缔组织层。HE 染色时，弹力纤维层较难观察，Elastin 染液可以使胸膜的弹力纤维染成蓝黑色。但有些患者胸膜中断裂、增生的弹力纤维较多，只有少量肿瘤细胞在弹力纤维层附近时，判读肿瘤细胞是否突破弹力纤维层存在较大难度。CK-pan 免疫组织化学染色联合弹力纤维染色（以下简称双重染色）时，肿瘤细胞细胞质呈棕色，弹力纤维呈蓝黑色，对比明显，能清楚显示肿瘤细胞与弹力纤维层的关系。双重染色结合了两者的优点并可同步显像胸膜及肿瘤细胞，能更好观察肿瘤细胞与周围胸膜之间的毗邻关系，对于明确病理诊断及制定临床治疗方案具有积极意义[1]。温州医科大学附属台州医院病理科常规操作双重染色耗时约21.5 h，染色时间过长，不能满足临床病理诊断时间的要求。笔者通过反复实验，对比滴染Elastin 染液后，分别采用室温过夜孵育（约18 h）、60 ℃烤箱孵育30 min、微波高档加热孵育60 s，发现60 ℃烤箱孵育对于提高双重染色的染色质量、缩短染色时间、节约试剂成本有积极意义，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂 选取本院2018 年1 至3 月诊断为肺癌胸膜侵犯并符合质控要求的30 例患者的病变组织蜡块30 个，患者男18 例，女12 例，年龄51～69（60.00±3.56）岁；样本类型为手术切除标本。所有蜡块均连续3 μm 切片3 张，各取1 张归入A、B、C 组。用阳离子玻片裱片，78 ℃烤片30 min。即用型CK-pan（鼠单抗AE1/AE3）购自中国福州迈新生物技术开发有限公司（批号：1907310049e）；二抗和DAB 均购自中国北京中杉金桥生物技术有限公司（批号：18101602）；即用型弹力纤维染色试剂盒购自中国珠海贝索生物技术有限公司（批号：619031）；液体封盖膜购自美国罗氏公司（批号：E31088）；油笔购自中国基因科技股份有限公司。

1.2 CK-pan 免疫组织化学染色 全部切片脱蜡至水；加入乙二胺四乙酸二钠溶液（pH 9.0）95 ℃左右水煮修复15 min，PBS 冲洗3 min×3 次；加入3%过氧化氢5 min，蒸馏水洗；距组织5 mm 处用油笔画线，蒸馏水洗，PBS冲洗3 min×3 次；滴加CK-pan 室温孵育60 min，PBS冲洗3 min×3 次；滴加二抗室温孵育15 min，PBS 冲洗3 min×3 次；滴加至DAB 显色3 min，蒸馏水洗。

1.3 弹力纤维染色 按1.2 所述免疫组化染色后，所有切片加入95%乙醇溶液稍洗，快速用吸水纸擦干组织划线两侧，滴加弹力纤维染色试剂盒的Elastin 染液。3组切片根据不同方法孵育：A 组室温过夜孵育（约18 h）；B 组60 ℃烤箱孵育30 min；C 组覆盖罗氏液体封盖膜微波高档孵育60 s。A、B、C 组切片加入95%乙醇溶液快速分化（镜下观察分化至弹力纤维组织清晰为止），自来水洗30 min，滴加Van Gieson 染液，室温孵育1 min，倾去染液，95%乙醇溶液快速洗去多余染液，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 双重染色评分 参考免疫组化和特殊染色质量评分表，设计双重染色质量评分表。在本科室医生中采用随机数字表法抽取2 位医生针对染色质量进行评分（总分10 分）：弹力纤维染色完整无缺失，肿瘤细胞阳性定位准确，背景清晰无非特异性着色，这三方面单项最高分3 分，最低分0 分；无脱片1 分，脱片扣0～1 分。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组切片双重染色情况比较 所有切片肺组织肿瘤细胞呈棕色，准确定位于细胞质，背景清晰，见图1（插页）。A 组所有切片Elastin 染液均完全干涸；B 组中29 张切片Elastin 染液未干涸，仅稍有挥发，1 张切片Elastin 染液小部分干涸；C 组中28 张切片Elastin 染液均匀覆盖，未见挥发，2 张切片Elastin 染液大部分干涸。A 组30 张切片均较难分化，整个背景非特异着色明显；B 组29 张切片容易分化，背景干净，1 张切片稍难分化，局部轻微背景着色；C 组28 张切片容易分化，背景干净，2 张切片较难分化，出现较大范围背景着色，见图2（插页）。

2.2 3 组切片双重染色评分与染色总时间比较 A 组双重染色评分（9.15±0.17）分，B 组（9.39±0.13）分，C 组（9.27±0.17）分，3 组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。A 组染色总时间（21.5 h）＞B 组染色总时间（4 h）＞C 组染色总时间（3.5 h）。

3 讨论

冯耀等[2]研究发现脏层胸膜侵犯（VPI）1、3 和5 年的肿瘤患者从接受治疗开始至发生任何原因死亡的时间（OS）均低于无VPI 组。双重染色可直观显示肿瘤细胞是否侵犯胸膜弹力层。双重染色包括免疫组织化学染色和弹力纤维染色，在临床上免疫组织化学染色技术已经十分成熟，因此双重染色的重点是控制好弹力纤维染色关键染液Elastin 染液滴染孵育的温度和时间，避免染液干涸，尽量使弹力纤维染色完整无缺失，背景清晰，无非特异性着色。

经免疫组织化学染色后，A 组Elastin 染液室温过夜孵育（约18 h），孵育时间过长，染液干涸，较难分化，组织出现非特异着色，干扰染色结果判读。B 组Elastin染液滴染60 ℃烤箱孵育30 min，少量挥发，试剂浓缩，弹力纤维的二硫键与Elastin 染液中间苯二酚的酚基在加热时更易形成氢键而使弹力纤维被染成蓝黑色[3]；B组1 张切片染液孵育过程中染液溢出划线处，部分干涸，局部轻微背景着色，基本不影响诊断，将玻片划线两侧尽量擦干，再滴加3～4 滴Elastin 染液可较好避免染液溢出划线处。C 组覆盖罗氏液体封盖膜微波高档孵育60 s，Elastin 染液处于罗氏液体封盖膜下，不会挥发，微波能发射高频能量，切片经微波辐射后会加速在组织内部的高速运动，加速组织的染色，同时还可缩短组织化学的染色[4]，弹力纤维染色快速高效完成；C 组孵育的缺点是Elastin 染液在微波作用下剧烈运动，有时罗氏液体封盖膜和Elastin 染液会流出划线区域，导致干片，切片被高温破坏，弹力纤维着色不佳。

金苏等[3]提出的双重染色改良方案是用Rubber Cement 橡胶胶水将组织圈起来，滴加Elastin 染液于线圈内，盖上盖玻片37 ℃孵育4 h，笔者的B 组改良染色方案比上述改良染色方案操作更便捷，染色时间更短。

综上所述，B 组Elastin 染液干涸情况较少，染色结果稳定，可降低VPI 疑难病例阅片难度，滴染成本低，操作简便，染色时间比传统染色法缩短约17.5 h，提高了临床对肺癌病理报告及时性和准确性的满意度，优点较多。希望更多的病理工作者了解这个快捷高效的方法，并推广应用。