厨余垃圾堆肥腐熟降解菌株的筛选与鉴定

王小兵 王海潮 汪晓丽 陈悦 程通 付宽宽

摘要：本研究旨在筛选厨余垃圾高效腐熟降解菌。采用秸秆平板培养基、刚果红培养基进行菌株的初筛，利用秸秆降解试验、滤纸崩解试验以及酶活性的指标进行复筛。结果表明，通过初筛获得了5株降解菌，其中菌株Y1、Y3的水解圈直径（H）与菌落直径（D）的比值（H/D）较大，分别为4.4、3.8，秸秆降解率分别达到42.50%、40.94%，而且2株菌株纤维素酶活性协同性较高。通过形态学和16S rDNA序列分析进行菌株种属的鉴定，菌株Y1、Y3均属于芽孢杆菌菌属（Bacillus），其中菌株Y1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），菌株Y3为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

关键词：腐熟降解菌;纤维素酶活性;序列分析;芽孢杆菌

中图分类号：S182;S141.4   文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）23-0213-06

收稿日期：2021-07-02

基金项目：国家自然科学基金面上项目（编号：41471236）;江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（20）3082、CX（17）3043];苏州市科技计划（编号：SNG2018088）。

作者简介：王小兵（1976—），男，江苏东台人，博士，副教授，主要从事有机固废废弃物资源化利用等研究。E-mail：xbwang@yzu.edu.cn。

厨余垃圾是指家庭、饭店以及各种餐饮机构抛弃的剩菜剩饭的统称[1]。据统计，我国在“十三五”末厨余垃圾产生量达到1.5×105 t/d，预计“十四五”期间将达到2.0×105 t/d[2]。目前，厨余垃圾的处理方式主要有焚烧、填埋、粉碎直排、肥料制作[3]。其中，肥料制作是廚余垃圾资源化利用的主要方式之一。而好氧堆肥又是肥料化处理厨余垃圾的主要方法[4]。由于厨余垃圾含有大量纤维素，而纤维素具有复杂的分子结构，很难被自然降解[5-6]，制约了堆肥腐熟的周期。相关研究结果表明，通过在堆肥中添加纤维素降解菌可以有效缩短堆肥腐熟的周期[7-8]。李雯等通过在玉米秸秆中加入纤维素降解菌使堆肥腐熟时间缩短3～5 d[7]。吴庆珊从羊粪中筛选出纤维素降解菌，将其加入羊粪中，缩短了堆肥腐熟周期[8]。目前，关于筛选厨余垃圾腐熟降解菌的报道较少。

本研究旨在筛选厨余垃圾腐熟降解菌，以提高厨余垃圾腐熟效率，为厨余垃圾资源化利用提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株来源：样品取自苏州市傲龙环保有限公司厨余垃圾处理厂，取回的样品放置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要培养基

赫奇逊氏无机盐培养液[9]：KH2PO4 0.5 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，NaNO3 1.25 g，FeCl3 0.005 g，CaCl2 0.05 g，蒸馏水500 mL，pH值7.2左右。

秸秆平板粉培养基：琼脂粉9 g，小麦秸秆粉 5 g，赫奇逊氏无机盐培养液500 mL。

秸秆产酶培养基：水稻秸秆粉10 g，赫奇逊氏无机盐培养液500 mL。

滤纸崩解培养基[10]：1 cm×6 cm的滤纸条3条，KH2PO4 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，（NH4）2SO4 0.3 g，酵母粉0.01 g，蒸馏水100 mL。

LB培养基：胰蛋白胨5 g，NaCl 5 g，酵母浸膏2.5 g，蒸馏水500 mL，pH值7.2。

以上培养基都在120 ℃下高温灭菌30 min。

1.3 菌株初筛

取10 g低温保存的堆肥于90 mL的无菌水中，放在（30 ℃，200 r/min）的恒温振荡箱中振荡 30 min，取下后静置10 min，取悬浮液1 mL，用无菌水稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 5个梯度浓度，吸取100 μL 10-5梯度的稀释液，均匀涂布于以秸秆为唯一碳源的秸秆平板培养基中。将培养基放在30 ℃的恒温培养箱中培养5 d，选取菌落直径较大的5株菌株进行分离与纯化，采用划线法纯化单菌落。将纯化好的菌株涂布在斜面培养基中，置于30 ℃恒温培养箱中培养1 d，放于4 ℃冰箱中保存备用。

将纯化好的菌株分别接种于羧甲基纤维素钠培养基，放置于恒温培养箱（30 ℃）中培养5 d，用 1 g/L 的刚果红溶液染色20 min后弃去染液，再用1 mol/L的氯化钠溶液洗涤30 min，根据透明圈直径与菌落直径的比值（H/D）初筛出产纤维素酶能力较强的菌株。

1.4 秸秆降解试验

将筛选出的产纤维素酶较强的菌株制成菌悬液，分别取10 mL菌悬液转接至秸秆降解培养基中，在恒温振荡培养箱（30 ℃、160 r/min）中培养12 d后取出秸秆。用蒸馏水反复冲洗5次，80 ℃烘至恒质量，每个处理做3个平行。秸秆的降解率按照减质量法计算[11]：秸秆降解率=[原秸秆质量（g）-烘干秸秆质量（g）]/原秸秆质量（g）×100%。

1.5 滤纸条崩解试验

将筛选得到的菌株制成菌悬液，分别将5 mL菌悬液转接至滤纸条崩解培养基中，置于恒温培养箱中（40 ℃，160 r/min）培养10 d，以未接种菌株的培养液做空白对照，观察滤纸的崩解情况。

1.6 纤维素酶活性测定

1.6.1 粗酶液制备 选取秸秆降解能力较强的几株菌株制成菌悬液，分别取10 mL菌悬液转接至液体产酶培养液中，在恒温培养箱（30 ℃，120 r/min）中连续培养15 d，每隔24 h取培养液8～10 mL，取出的培养液用0.45 μm的水系滤头过滤，过滤液即为粗酶液。

1.6.2 酶活力测定 葡萄糖标准曲线参照张冬雪等的方法[12]进行绘制。

纤维素酶是多酶复合物，包含3种主要成分，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，这3种酶活性的测定方法参考于慧娟等方法[13]。酶活力定义为1 mL原酶液每分钟催化底物产生1 μg对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位（μmol/mL）[14]。

1.7 菌株种属鉴定

参照《伯杰氏菌株鉴定手册（第8版）》《常见细菌系统鉴定手册》和革兰氏染色法，对菌株进行形态学鉴定[15-16]。

参考Yu等的方法[17-18]提取细菌总DNA。正向引物为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为20 μL，反应条件为：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共28个循环。PCR产物经纯化后送至上海凌恩生物科技有限公司进行测序。将测序得到的菌株DNA序列在NCBI中进行Blast序列比较分析。用MEGA 7.0构建菌株16S rDNA系统发育树。

2 结果与分析

2.1 堆肥中纤维素降解菌的初筛

从秸秆培养基中筛选出菌落直径较大的5株菌株，分别命名为Y1、Y2、Y3、S1、C1。5株菌株在羧甲基纤维素钠培养基中的透明圈直径与菌落直径的比值（H/D）见图1、表1。其中菌株Y1的透明圈直径与菌落直径的比值（H/D）最大，二者之比达到了4.4，菌株Y2的透明圈直径与菌落直径的比值（H/D）最小，仅为1.8。通过对比选取透明圈直径与菌落直径比值（H/D）较大的4株菌株Y1、Y3、S1、C1进行下一步研究。

2.2 秸秆降解试验

将初筛选出的4株菌株制成菌悬液，分别取 5 mL 的菌悬液接种到秸秆降解培养基中，培养 10 d，通过降解前后秸秆的质量比，比较不同菌株对秸秆的降解效果。结果显示，接种过菌株Y1、Y3的秸秆培养基中秸秆的降解效果最好，秸秆降解率分别达42.50%、40.94%。秸秆降解率较低的是菌株S1、C1，秸秆降解率分别为19.69%、16.31%（图2）。

2.3 滤纸崩解试验

滤纸的降解情况可以体现出菌株产酶能力的强弱。从表2可以看出，培养10 d后，在接种了菌株Y1的培养基中，滤纸基本上被完全分解形成糊状（++++），在接种了菌株Y3的培养基中滤纸崩解形成近似糊状（+++），而接种了菌株S1、C1的培养基中，滤纸的崩解效果稍差，形成了若干不同大小的块状（++），作为对照的培养基中，滤纸基本上无任何变化（+）。通过对比发现，筛选出的4株菌株都具有使滤纸崩解的能力，其中菌株Y1对滤纸的崩解效果最好，菌株Y3对滤纸的崩解效果次之，菌株S1、C1对滤纸的崩解效果较差。该结果与秸秆降解试验的结果完全符合，验证了秸秆降解结果的可靠性。

2.4 不同菌株纤维素酶活性测定

纤维素酶是多酶复合物，包含3种主要成分，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[13]。將菌株Y1、Y3 、S1、C1制成菌悬液，分别接种至液体产酶培养基中，培养15 d。分别测量4株菌株每天的外切葡聚糖酶活性、内切葡聚糖酶活性和 β-葡萄糖苷酶活性。

从图3可以看出，在连续15 d的培养过程中，4株菌株的外切葡聚糖酶活性在整体上都呈现出先增后降的趋势， 在6 d时达到最大， 其中菌株Y1的

最大外切葡聚糖酶活性强于其他3株菌株，达到了21.54 μmol/mL，菌株Y3的最大外切葡聚糖酶活性仅低于菌株Y1，为 20.53 μmol/mL，较差的是菌株C1、菌株S1，它们的最大外切葡聚糖酶活性分别为13.31、10.80 μmol/mL。

从图4可以看出，菌株Y1、菌株Y3的内切葡聚糖酶活性在前6 d呈现不断增加的趋势，在6 d时达到峰值，分别为25.63、23.69 μmol/mL，随后出现下降趋势，这与它们的内切葡聚糖酶活的变化趋势相似。菌株S1在前13 d内外切葡聚糖酶活呈现缓慢上升的趋势，在13 d时达到最大，为33.41 μmol/mL，随后快速下降，在达到最大值的2 d内切葡聚糖酶活降为10.99 μmol/mL。菌株C1的内切葡聚糖酶活在3 d达到最大，最大值为26.36 μmol/mL，随后出现缓慢下降的趋势。

从图5可以看出，菌株Y1的β-葡萄糖苷酶活性的变化趋势与它的内、外葡聚糖酶活性的变化趋势相似，即先增后降。在6 d时菌株Y1的β-葡萄糖苷酶活性达到最大，最大值为18.41 μmol/mL。菌株S1的β-葡萄糖苷酶活性在前6 d呈现缓慢上升趋势，7 d 时达到最大值，最大值为10.70 μmol/mL，随后开始下降。在1～5 d，菌株C1的β-葡萄糖苷酶活性呈现缓慢上升的趋势，6 d时酶活性相较于 5 d 时有了大幅度提高，在7 d时达到最大，最大值为 16.67 μmol/mL。相较于其他3株菌株，菌株Y3在整个试验周期中β-葡萄糖苷酶活性一直处于较低水平，但它的整个变化趋势与它的内、外葡聚糖酶活性相似，即先增后降，在6 d时达到最大，最大值为8.84 μmol/mL。

2.5 菌株形态学鉴定

通过秸秆降解试验、滤纸崩解试验和菌株酶活性的测定最终选出菌株Y1、菌株Y3进行下一步形态学的鉴定。

对2种菌株进行形态学鉴定，鉴定结果：菌株Y1为白色、表面粗糙不规则、边缘不平整、不透明、难以挑取;菌株Y3近似圆形，白色、不透明、边缘较平整、表面光滑、中间凸起、易挑取。革兰氏染色结果全呈蓝紫色，为革兰氏阳性菌。

2.6 菌株种属鉴定

为了确定菌株Y1、Y3的分类学地位，将2株菌株测序得到的16S rDNA序列提交到NCBI进行Blast比对，利用MEGA 7.O软件中的邻接法构建2株菌株的系统发育树。进化树构建时使用嗜碱甲烷杆菌（Methanobacterium alcaliphilum，AB496639.1）作为外类群，其他近源物种的选择通过Blast以及NCBI Taxonomy数据库确定。从进化树来看，菌株Y1、Y3均属于芽孢杆菌（Bacillus），其中菌株Y1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain YEBN5，MT372156.1）聚在同一支（图6），菌株Y3 与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis strain FZB42，NR_075005.2）进化距离最近，聚在同一支（图7）。在NCBI上提交菌株序列后获得2株菌株的登录号，分别为MW767002和MW757344。

3 讨论与结论

目前，大部分纤维素降解菌在初筛过程中使用刚果红染色法进行初筛，这样会造成菌落间的混杂以及假阳性现象。本研究先用秸秆培养基进行筛选，再用刚果红染色法进一步筛选可以避免这一情况[13]。秸秆培养基初筛出的3株菌株透明圈直径（H）与菌落直径（D）的比值（H/D）都大于3，高于高双喜等的研究结果[19-20]，表明腐熟的厨余垃圾有机肥中存在纤维素降解能力强的菌株。

通过初筛选出的4株菌株对秸秆的降解结果与对滤纸的崩解结果一致，说明各菌株对滤纸的崩解效果可以反应出各菌株的纤维素降解能力，其中效果較好的是菌株Y1、Y3。在纤维素酶活性测定中，菌株Y1的内、外葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活峰值均处于较高水平，分别为25.63、21.54、18.41 μmol/mL，本结果高于众多已有报道[5，9]，王洪媛等筛选出2株纤维素降解菌W3和98MJ，它们的纤维素酶活性分别在4.17～9.46、 2.95～5.78 μmol/mL之间[9]。 张海艳等从土壤中筛选出2株菌株WL1、WL2，它们的纤维素酶活力分别为0.005 3、0.005 9 μmol/mL[5]。

在连续15 d的产酶试验周期中，可以发现4株菌株都具有内切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性和 β-葡萄糖苷酶活性，且4株菌株纤维素酶活性的变化趋势相同，即先增后降。菌株Y1、菌株Y3的3种酶活性都在6 d时达到最大，而菌株S1、C1的3种酶活性峰值出现在不同的时间。菌株Y3的外切葡聚糖酶活性和β-葡萄糖苷酶活性小于菌株S1和C1，但它的秸秆降解结果和滤纸崩解结果都要强于菌株S1和C1，可能的原因是菌株Y3的3种酶活性峰值都出现在同一天，表明3种纤维素酶具有很强的协同作用，协同性越高菌株的纤维素降解能力越强[21]。

经鉴定，菌株Y1、Y3都属于芽孢杆菌属（Bacillus）。其中，菌株Y1属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），具有较好的降解效果，这与周东兴等的研究结果[22-23]一致;菌株Y3属于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌株是芽孢杆菌中的一个新种，属于革兰氏阳性好氧细菌，菌体成杆状，内生孢子，具有广普抗菌活性[24-25]。目前关于贝莱斯芽孢杆菌的研究主要集中在诱导系统抗性、抑菌物质及其基因簇鉴定、拮抗机制等方面[25-27]，在纤维素降解能力方面的研究报道较少。Chen等采用基因组学分析了24株贝莱斯芽孢杆菌，表明其对纤维素具有潜在的降解能力[28]。本次试验的研究结果进一步证实贝莱斯芽孢杆菌与其他降解菌株相比较具有较强的纤维素降解效果。

本研究筛选出的菌株Y1、菌株Y3均具有较强的纤维素降解能力，后期将研制以菌株Y1、菌株Y3为主的厨余垃圾腐熟降解复合菌剂，以提高厨余垃圾腐熟降解效率，为厨余垃圾无害化、资源化利用提供技术支持和理论依据。

本研究从腐熟的厨余垃圾堆肥中初筛选出5株纤维素降解菌，经过秸秆降解试验、滤纸崩解试验以及3种酶活性的测定，确定菌株Y1、菌株Y3在筛选出的5株菌株中具有较强的纤维素降解能力。通过对菌株Y1、菌株Y3进行形态学以及菌株种属的鉴定，鉴定结果表明，2株菌株均属于芽孢杆菌（Bacillus），其中菌株Y1属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、菌株Y3属于贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis） 。

参考文献：

[1]徐 栋，沈东升，冯华军.厨余垃圾的特性及处理技术研究进展[J]. 科技通报，2011，27（1）：130-135.

[2]常燕青，黄慧敏，赵振振，等. 餐厨垃圾资源化处理与高值化利用技术发展展望[J]. 环境卫生工程，2021，29（1）：44-51.

[3]鲁 帅，张 红，梁淑霞，等. 厨余垃圾处理现状及建议[J]. 安徽农学通报，2017，23（16）：87-88.

[4]刘晓飞，郑志辉，宋 洁，等. 纤维素的降解制备及应用研究进展[J]. 食品工业，2020，41（2）：249-253.

[5]张海艳，王文磊，韩 锰.纤维素分解菌的筛选与鉴定[J]. 安徽农业科学，2020，48（15）：1-3，8.

[6]李冠杰，刘莹莹，甄 静，等. 一株降解纤维素细菌的分离、鉴定及酶学性质分析[J]. 河南科学，2015，33（4）：530-534.

[7]李 雯，刘艳薇，李停锋，等. 不同纤维素降解菌对玉米秸秆的降解效果[J]. 生态环境学报，2020，29（2）：402-410.

[8]吴庆珊.纤维素降解菌筛选及其在羊粪堆肥发酵中的应用[D]. 贵阳：贵州师范大学，2018.

[9]王洪媛，范丙全.三株高效秸秆纤维素降解真菌的筛选及其降解效果[J]. 微生物学报，2010，50（7）：870-875.

[10]毛 婷，魏亚琴，张苗苗，等. 产纤维素酶混合菌发酵优化及秸秆降解研究[J]. 饲料研究，2020，43（6）：56-62.

[11]耿丽平，薛培英，刘会玲，等. 促腐菌剂对还田小麦秸秆腐解及土壤生物学性状的影响[J]. 水土保持学报，2015，29（4）：305-310.

[12]张冬雪，文亚雄，罗志威，等. 纤维素降解菌的分离筛选及其对水稻秸秆的降解效果分析[J]. 江西农业学报，2020，32（1）：72-76.

[13]于慧娟，郭夏丽.秸秆降解菌的筛选及其纤维素降解性能的研究[J]. 生物技术通报，2019，35（2）：58-63.

[14]李鹏飞，廖 奇，陶 杨，等. 一株纤维素降解菌的筛选、鉴定及对饲料粗纤维降解效果的研究[J]. 饲料工业，2020，41（12）：31-37.