Wnt/β-catenin 信号通路在结直肠癌中的研究进展

焉秀章，夏文龙，夏俊伟,张海山

(吉林大学中日联谊医院 胃肠外科，吉林 长春130033)

结直肠癌(CRC)是目前消化系统常见的恶性肿瘤之一，近年来结直肠癌的发病率逐年上升，结直肠癌的高发病率、死亡率严重影响着人类的健康[1]。而与结直肠癌相关的细胞信号转导通路有多条，如Wnt/β-catenin信号通路、TGF-β/Smads信号通路、Hedgehog信号通路等，其中Wnt 通路的异常激活是导致结直肠癌发生、发展的主要原因。研究显示，在结直肠癌的发生、发展、转移、复发及相关治疗的过程中，Wnt/β-catenin信号通路的异常激活起到了重要作用，大部分结直肠癌存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活[2]。Wnt信号通路可分为经典通路和非经典通路,其中Wnt经典通路，即Wnt/β-catenin 信号通路目前研究较为深入。本文对Wnt/β-catenin 信号通路与结直肠癌关系的研究进展进行综述。

1 Wnt/β-catenin经典信号通路的成员及其转导过程

1.1 Wnt经典信号通路的主要成员

Wnt经典信号通路的主要成员包括Wnt家族分泌蛋白(Wnt)，包括腺瘤息肉病大肠杆菌蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)、支架蛋白(Axin)、β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、卷曲家族跨膜受体蛋白(frizzled,Frz)、辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptorrelated protein 5/6,LRP5/6)、细胞质内的松散蛋白(Dishevelled,Dsh)、酪蛋白激酶1(carsein kinase,CK1)、T细胞因子/淋巴增强因子(Tcellfactor/lymphoid enhance factor,TCF/LEF)家族转录调节因子等。

1.2 Wnt经典信号通路转导过程

Wnt/β-catenin 经典通路的转导过程为：当细胞膜外的Wnt家族分泌蛋白作为配体与Frizzled(Fz)家族受体的氨基末端结合时，Wnt信号开始。Frizzled(Fz)家族受体与相应配体结合后反复跨越质膜7次，从而形成了G蛋白偶联受体家族(GPCR)，使得胞内的Dsh蛋白磷酸化,并与β-catenin 降解复合体(主要由GSK-3β、Axin、APC组成)中的Axin结合并破坏其结构。β-catenin降解复合体的功能是泛素化β-catenin蛋白并将其初步分解破坏其结构，并将其送入胞内溶酶体进行进一步消化。Wnt /β-catenin 经典通路中β-catenin 降解复合体的破坏使细胞分解β-catenin 的能力大大下降，从而提高了细胞内β-catenin浓度。β-catenin 在胞质中积累达到一定浓度后转位进入细胞核并与T细胞转录因子/淋巴样增强因子(TCF/LEF)作用，诱导Wnt最终作用的目标基因转录，诱导后续细胞反应的发生，进而导致肿瘤的发生和发展。

2 Wnt/β-catenin经典信号通路与结直肠癌的关系

Wnt经典信号通路参与了许多哺乳动物的重要生理过程，如人类胚胎的形成、分化及增殖都与该通路的精确调控密切相关。但该通路的异常激活会导致腺瘤甚至结直肠癌的发生及发展。肠上皮细胞的基因突变及基因损伤可使Wnt经典信号通路异常激活，使细胞大量增殖并形成腺瘤，当突变逐渐积累，将导致腺瘤最终进展为结直肠癌，并进一步发生增殖、侵袭、转移与复发。研究显示，Wnt 通路的异常激活是导致结直肠癌发生、发展的主要原因且大部分的结直肠癌存在Wnt/β-catenin 信号通路的异常激活[2]。因此，在结直肠癌的发生与发展中，Wnt/β-catenin经典信号通路的异常激活起到了至关重要的作用。

3 影响 Wnt 经典通路的相关因子

3.1 APC

APC(adenomatous polyposis coli)是一种抑癌基因，定位于染色体5q21-q22,其编码的 APC蛋白是一个可多功能抑制肿瘤的蛋白家族，它定位于结直肠黏膜上皮细胞的基膜并直接参与 Wnt 信号通路。APC蛋白几乎在所有脏器表达,但其mRNA在结肠粘膜细胞中的含量较高。APC 蛋白作为 Wnt 信号通路关键的效应因子可与Axin、β-catenin结合，其主要功能是下调胞浆内游离的β-catenin 水平，进而抑制β-catenin进入细胞核以及对下游基因的激活与转录功能。APC基因的突变会异常激活 Wnt/β-catenin经典信号通路，从而促进细胞大量增殖、分化，并诱发癌变，且APC基因是公认与结直肠癌发生的密切相关的重要基因。临床研究显示，约70%的结直肠癌存在APC 基因缺失或突变[3]。当APC基因发生突变时,其蛋白中原本应与β-catenin结合的区域发生异常,从而无法下调β-catenin的表达,并使其转移至细胞核,进而引发细胞异常增殖,最终导致腺瘤及结直肠癌的发生[4]。相关研究显示，在APC突变并激活Wnt/β-catenin信号通路异常传导过程中，可刺激大量与增殖相关的靶蛋白基因的转录，例如细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和不稳定编码区结合蛋白(coding region determinant binding-protein,CRD-BP) 等[5]。这些靶蛋白的大量转录及表达将进一步刺激结直肠腺瘤增殖，并抑制其分化成熟及凋亡，这表明APC蛋白参与了Wnt/β-catenin经典信号通路并在其中扮演了重要角色，对结直肠癌的发生具有重大影响及意义。研究[6]表明USP7(去泛素化酶)可以通过介导β-Catenin的去配基作用来治疗存在APC突变的CRC(colorectal cancer)。USP7通过在APC突变的CRC中恢复β-Catenin的泛素化从而抑制Wnt激活，进而抑制肿瘤的生长。不难看出，APC突变在引发肠道肿瘤的形成中起了关键作用，且对APC基因突变的研究可以发现潜在的结直肠癌治疗靶点。另外，有研究显示APC与癌细胞的异常迁移有关[7]，其具体机制为APC与其受体Asef结合并减轻了Asef的负性调节，从而导致人类结直肠癌中的异常细胞迁移，进而可能导致癌细胞的侵袭与转移。APC 蛋白可能是另外一个双功能蛋白的例子(双功能：作为信号通路和细胞迁移两个过程关键的直接参与者)，即在Wnt信号通路和结直肠癌细胞迁移过程中发挥着不同的作用。然而目前并没有APC蛋白同时参与这两个过程的明确证据，相关问题有待进一步的研究。

3.2 Axin

Axin是Wnt/β-catenin经典信号通路的基因之一。Axin基因编码两个蛋白：Axin1和Axin2蛋白，都是具有相似功能的肿瘤抑制剂。虽然Axin1广泛表达，但Axin2仅在Wnt信号通路中表达。Axin2蛋白是一种大分子框架蛋白,包含Wnt/β-catenin经典信号通路中多个重要成员的结合位点，在正常细胞中，Axin2蛋白是Wnt/β-catenin经典信号通路的负性调节因子。但Axin2基因并不是一个抑癌基因，而是一个有力的促癌启动子，它可以上调Snail(转录抑制因子)的活性，诱导EMT(上皮细胞向间质转化)过程，从而促使CRC细胞发生转移[8]。有研究显示，Axin2基因的突变之一位于1989G>A等位基因，它导致产生截短形式的Axin2蛋白(trAXIN2)，trAXIN2可以抑制GSK3β，稳定snail[9]，从而影响CRC的发生、侵袭与转移。该研究明确了Axin基因的突变或损伤导致了Axin2蛋白的减少并通过Wnt/β-catenin经典信号通路影响结直肠癌的发生与发展。随着研究逐渐深入,人们开始发现Axin对Wnt/β-catenin经典信号通路实际上可以发挥双重调节的作用[10]。一方面,Axin可以通过参与β-catenin 降解复合体的形成,促进β-catenin的降解,发挥抑制Wnt/β-catenin经典信号通路的作用;另一方面,Axin可以通过与LRP5/6的相互作用和加速GSK-3β进入细胞膜促进LRP5/6的磷酸化,开启Wnt/β-catenin经典信号通路。在CRC的治疗中，Axin也具有重要作用：NAMPT(烟酰胺磷酸核糖基转移酶)可以通过增加Axin表达水平来诱导β-catenin 降解；这抑制了Wnt/β-catenin经典信号通路和结直肠癌细胞的增殖与发展[11]。在结直肠癌患者中，miR-103/107 表达与 Axin2 表达呈负相关，并且 miR-103/107 高和 Axin2 低表达谱的特征与患者的不良预后相关[12]。USP44(去泛素化酶)可以通过 Axin1的去泛素化使 Wnt/β-catenin 通路失活，从而抑制结直肠癌细胞的增殖并增强细胞凋亡[13]。这些新进展说明Axin在Wnt/β-catenin经典信号通路中有着重要作用并影响CRC的诊断，预后和治疗。关于Axin构成β-catenin 降解复合体并参与一系列相关反应的研究较为深入，其药物及治疗也是目前研究热点，但Axin2的其他生理功能研究尚少。

3.3 GSK-3β

GSK3β基因位于3q13.33，其编码的蛋白GSK-3β是一种广泛分布于体内各处细胞内的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶,GSK-3β蛋白通过其对底物的磷酸化作用并调节多种细胞信号转导途径并参与多种病理生理过程，包括神经营养因子信号、神经递质信号、微管动力学和Wnt信号通路等[14]。在Wnt/β-catenin经典信号通路转导途径中,GSK-3β的主要功能是使β-catenin的N端的Ser/Thr磷酸化进而使β-catenin降解,从而调节β-catenin的细胞内含量，进而影响Wnt/β-catenin经典信号通路并引发结直肠癌。另外，GSK-3β还参与β-catenin降解复合体的构成，因此，GSK3β被认为是通过Wnt/β-catenin经典信号通路抑制癌症发展的关键因素。哺乳动物GSK3基因编码两个蛋白，称为GSK3α和GSK3β，不同之处在于GSK3α中存在一个扩大的富含甘氨酸的氨基末端。虽然GSK-3α和GSK3β似乎都在β-catenin的破坏中起作用，但大多数研究都集中在GSK3β上[14]。有研究显示[15]，橙皮苷 (NG，Nerigoside)可以通过抑制ERK/GSK3β/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞的生长并阻止细胞增殖和迁移，且NG与 GSK3β抑制剂联合阻断Wnt/β-catenin经典信号通路可获得更好的结果。另一项研究显示：GSK3β抑制剂可以稳定TRAF6(泛素连接酶)，从而促进了 CTNNB1基因编码的蛋白质的分解，从而有效抑制了 EMT 过错和 CRC的转移[16]。Yao等的研究显示：PP9(甾体皂苷)通过PI3K/Akt/GSK3β信号抑制促进CRC细胞的G2/M期阻滞和凋亡死亡[17]，这表明PP9可被视为通过GSK3β信号抑制来治疗CRC的新候选药物。GSK3β抑制剂及相关药物通过抑制GSK3β的活性并影响结直肠癌细胞的发生、进展成为了前沿的研究热点。

3.4 miRNA

MicroRNA (miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子。其调节多种致癌途径，有研究表明[18]miRNA在结直肠癌的进展和转移中发挥着重大的作用，也是非常有价值的肿瘤标志物。miRNA对Wnt/β-catenin经典信号通路的影响是多方面的，不同的miRNA可激活或抑制Wnt/β-catenin经典信号通路，从而影响肿瘤细胞的生长。研究显示，APC突变与结直肠癌患者几种miRNA的上调有关，APC基因是人结直肠癌细胞中miR135a/b的靶基因，而miR135b的过度表达与晚期肿瘤分级和不良临床结果相关[19]，以上研究说明了miRNA可以影响APC进而影响Wnt/β-catenin经典信号通路。Guo等的研究显示，miR-15b通过上调β-catenin和抑制结肠癌细胞中β-catenin 降解复合体的成分Axin2来诱导异常细胞的增殖和转移且MiR-15b在结直肠癌细胞中升高，并与与患者预后不良相关[20]。miR-224是一种致癌miRNA，它可以直接靶向Wnt/β-catenin经典信号通路的抑制因子，包括GSK3β和分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)，从而使β-catenin在细胞质中积累并转入细胞核，导致结直肠癌的发生与发展[21]。根据研究结果显示 miR-144-3p 可以通过BCL6 的介导抑制CRC细胞中异常激活的Wnt/β-catenin经典信号通路。miR-144-3p在CRC细胞的中含量的降低，与CRC患者的肿瘤进展与分期相关[22]。以上研究表明，某些miRNA对CRC有抑制效果。不难看出，在结直肠癌的发生过程中，miRNAs影响了整个Wnt途径，包括APC、Axin、GSK3β、Frizzled等Wnt/β-catenin经典信号通路的重要成员。

4 以Wnt经典信号通路为靶点的抗肿瘤治疗进展

4.1 非甾体抗炎药物(NSAIDs)

非甾体抗炎药对预防癌症和肿瘤治疗都有积极作用。研究表明，Wnt/β-catenin经典信号通路与慢性炎症和氧化应激密切相关，而非甾体抗炎药可以使细胞内β-catenin降解并抑制Wnt/β-catenin经典信号通路[23]，如阿司匹林、舒林酸、艾西舒林和塞来昔布等非甾体抗炎药可以通过抑制细胞内β-catenin的水平来降低β-catenin/TCF/LEF复合物的转录活性[24]。研究表明[25]：双氯芬酸和塞来昔布降低了β-catenin的靶基因 Axin2、细胞周期蛋白 D1 和c-Myc的表达。此外，在双氯芬酸和塞来昔布治疗后，β-catenin的细胞质积累和核转位显着减少，且双氯芬酸和塞来昔布显着增加了β-catenin 的磷酸化并降低了GSK3β的磷酸化。以上研究说明了非甾体抗炎药可以影响Wnt/β-catenin经典信号通路中的重要因子β-catenin从而达到其相关抗肿瘤效果。另外，早有研究[26]显示非甾体抗炎药物具有一定的抗肿瘤能力并提示其可以预防结直肠肿瘤，非甾体抗炎药对结直肠癌预防作用的途径包括诱导细胞周期停滞及凋亡和抑制血管的生成。Bowen等人的研究显示，NSAID(舒林酸)和rexinoid(贝沙罗汀)联用可通过Wnt/β-catenin经典信号通路预防家族性腺瘤性息肉病的肠道癌变[27]。这表明非甾体抗炎药可有效预防CRC。另外，非甾体抗炎药可以下调环氧化酶-2的活性，从而抑制前列腺素E2的合成，进而抑制Wnt/β-catenin经典信号通路[28]。但传统非甾体抗炎药物(如舒林酸、阿斯匹林)作为抗癌药物时的严重不良反应也不容忽视，常见的副作用包括：胃肠道反应、肝肾损伤等，长期应用NSAIDs也会同时造成体重增加、水肿形成和液体潴留。因此,在Wnt/β-catenin经典信号通路的治疗策略上，如何应对非甾体抗炎药的严重副作用对CRC患者的影响是十分重要。

4.2 Wnt/β-catenin经典信号通路中的其他负性调节因子

许多Wnt/β-catenin经典信号通路中的负性调节因子也是抗结直肠肿瘤的治疗靶点。Cha等的研究发现，KY1220，一种新型小分子试剂，可以附着在Axin的RGS结构域上，这种小分子可以使β-catenin 降解复合体更加稳定，从而导致GSK3β的激活和Ras(另一种参与CRC的癌基因)的磷酸化和降解。另外，KY1220还可以抑制APC突变引起的肿瘤生长[29]。氯喹醛(CQD)是一种用于治疗皮肤感染的局部抗菌剂，给予CQD可以抑制肿瘤生长并降低Wnt靶基因c-Myc和G蛋白偶联受体-5 (LGR5)的表达[30]。Thorvaldsen等的研究表明Tankyrase1和2(聚腺苷二磷酸核糖转移酶)通过使Axin降解来刺激Wnt/β-catenin经典信号通路。另外，一些Tankyrase抑制剂如G007-LK和XAV939是昂贵的抗肿瘤药物，可在在保留Axin的情况下阻断Wnt/β-catenin经典信号通路[31]。以上研究表明作用于Axin的负性调节因子在逐渐被开发，但其具体疗效及在临床上的应用尚欠缺进一步的验证。盐霉素(salinomycin，SAL)是最早发现的人类癌症干细胞 (CSC)抑制剂之一，也是LRP6(低密度脂蛋白受体相关蛋白6)的抑制剂，它可以降解抑制Wnt信号传导从而抑制CRC的发生与发展[32]。盐霉素纳米晶体(SAL NCS)表现出显着更高的细胞毒性，具有比游离 SAL高1.5-3 倍的Wnt抑制效果和10倍的癌症干细胞抑制效果。此外，与游离 SAL 相比，SAL NCs 通过口服给药在 APC 转基因小鼠中表现出双倍的抗CRC作用[33]。以上研究说明盐霉素是通过Wnt/β-catenin经典信号通路对抗CRC的重要负性调节因子。此外，通常用于镇静及神经相关疾病的锂也可以通过靶向GSK3β在结直肠癌中显示出抗癌作用[34]。近年来，多种单克隆抗体在结直肠癌治疗中的作用越来越受到关注。例如，单克隆抗体vanitatumab(OMP-18R5)与FZD受体相互作用，可以抑制结直肠癌小鼠的Wnt/β-catenin信号通路[35]。另外，上文提到的miRNA如miR-520e[22]也是Wnt/β-catenin经典信号通路中的负性调节因子。随着对Wnt/β-catenin经典信号通路研究的深入，更多相关靶点及抑制相关因子的药物也在被不断发现。

4.3 天然化合物

近期，一些天然化合物被证明可以通过影响Wnt/β-catenin经典信号通路来改变结直肠癌的病理过程并有效预防、治疗结直肠癌。研究显示，维生素d3(1，25(OH)2D3)可以促进β-catenin与维生素D受体的结合，并增加E-钙粘蛋白的表达，从而减少可与TCF/LEF转录因子结合的β-catenin[36],较高的血浆1，25(OH)2D3水平与降低结直肠癌风险和提高生存率相关。木黄酮(Genistein)是一种大豆来源的异黄酮和植物雌激素，它通过上调GSK3β和E-钙粘蛋白的表达来灭活Wnt信号，在对抗异常细胞对氟嘧啶和铂类化合物的耐药性方面发挥作用[37]。马钱子碱(brucine)是存在于天然植物马钱子中的一种活性生物碱，其可以增强细胞内APC的表达从而通过Wnt/β-catenin经典信号通路显著抑制肿瘤细胞的生长[38]。姜黄素是一种来自于植物姜黄根茎的天然化合物，目前研究已证明其在体外对多种癌细胞具有抗增殖的作用，这源自其抑制Wnt活性的能力：姜黄素可以通过抑制Wnt-β-catenin信号通路的CDX2(caudal type homeobox-2，一种肠特异性的核转录因子)来减少细胞增殖和增加凋亡[39]。随着研究的逐步深入，越来越多的天然化合物尤其是中药提取物被发现可以在Wnt/β-catenin经典信号通路中发挥作用，抑制其异常的激活并影响了CRC的发生与发展。因此，在结直肠癌的治疗中加强对天然化合物的研究是一项有效的治疗策略。

5 结语

结直肠癌的高发病率与高死亡率严重危害人类健康。结直肠癌的发生发展过程中，包括Wnt/β-catenin经典信号通路在内的不同分子通路如Notch、Hedgehog、TGF-β等重要通路所涉及的下游靶点基因突变仍存在研究上的盲点。多数影响CRC的通路其机制十分复杂，如哺乳动物的Wnt信号通路至少有15种受体、19种Wnt配体分布在7个蛋白质家族中[40]。此外，Wnt信号通路是结直肠癌发病机制中最关键的过程，包括APC、Axin及GSK3β在内的多种因子参与了这一途径，其中每种因子的突变都可能导致Wnt/β-catenin经典信号通路的异常激活。了解这些靶点潜在的遗传突变对于早期诊断和开发新的靶向药物至关重要，也给开发安全有效的CRC治疗药物带来了挑战。随着研究进一步的进展，未来会诞生更多基于Wnt经典信号通路的抗结直肠癌的分子靶向药物,为结直肠肿瘤的治疗提供更多的选择。