温经通络汤对小鼠膝骨关节炎软骨形态改变和VEGF、MMP-13、HIF-1α表达情况的影响

许炜民，钱佳佳，韩龙，许奇，黄桂成,2*

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属江苏省中医院，江苏 南京 210023)

膝骨关节炎是我国乃至世界范围内中老年的常见病之一，其发生发展的过程与年龄、体质量、创伤、运动习惯、地理环境等诸多因素密切相关。膝骨关节炎的发生，给广大患者日常生活造成了极大的痛苦与不便。据统计，我国60周岁以上的人群中，其中65岁以上人群发病率超过50%，75岁以上人群则高于80%[1]。。江苏省中医院黄桂成教授在治疗此类疾病时，认为其发病机理无非是风、寒、湿三种致病因素侵袭肌理，从而造成局部的疼痛、肿胀、运动障碍。在治疗过程中运用祛风散寒、温通经脉、活血止痛等方法，往往能达到药到病除的效果。本研究自2019年5月—2019年11月研究温经通络汤对膝骨关节炎小鼠的治疗作用及其作用机制是否与血管侵袭即VEGF信号通路有关。旨在观察温经通络汤对血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的影响，以进一步明确其对KOA的治疗作用机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康3月龄C57BL/6雄性小鼠30只，体质量(20±2)g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，许可证号SCXK(苏)2012-0008，合格证号：201831343。在无特定病原体(SPF级)条件下常规喂养，12 h/12 h光暗交替，恒温恒湿，标准化颗粒饲料、饮用水、垫料及其他相关物品均经灭菌处理。本实验方案由南京中医药大学实验动物伦理委员会审核(201904A009)。

1.2 分组

将小鼠在20 ℃～26 ℃(SPF级)实验室适应性喂养7 d，依据随机分配原则分为5组，每组6只。分别为假手术组(A组)、模型组(B组)、温经通络汤高剂量组(C组)、温经通络汤低剂量组(D组)和阳性药(美洛昔康)组(E组)。

1.3 主要试剂及仪器设备

苏木素染液、伊红染液(中国，南京建成公司，D005)；VEGF、MMP-13、HIF-1α ELISA检测试剂盒(镇江爱必梦生物科技有限公司)；石蜡切片机(Leica,RM2245)；组织包埋机(Leica，EG1150H/C)；免疫组化笔(中国，江苏凯基生物技术股份有限公司，KGSP10)；倒置生物显微镜(CKX31，Olympus，日本)。

1.4 药物制备及干预处理

依据《中药药理研究方法学》剂量估换计算公式：dB=dA×KB/KA，将成人每日服药量折算为小鼠每日服药量(温经通络汤组成：制附子、桂枝、熟地黄、土茯苓、泽泻、陈皮、胆南星、延胡索、全蝎、蜈蚣、怀牛膝和甘草。均由江苏省中医院药剂科提供)。将温经通络汤煎煮浓缩至2 g/mL，每只小鼠每日灌胃0.2 mL。将美洛昔康胶囊内粉末溶于水，并定容为10 mL/(kg·d)。造模成功后A组与B组分别予以10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，C组(药物浓度为2 g/mL)与D组(药物浓度为1 g/mL)分别予以10 mL/(kg·d)温经通络汤灌胃，E组予以10 mL/(kg·d)美洛昔康水溶液灌胃，持续2周。

2 检测指标与方法

2.1 模型建立

对于A组的C57BL/6小鼠，打开关节腔后直接缝合。其余各组予以ACLT法建立膝骨关节炎模型：实验小鼠予以戊巴比妥钠麻醉后取仰卧位，于膝关节内侧面做约7 mm纵向切口，眼科剪逐层玻璃皮下组织，膝关节伸直位时将膑前韧带推向外侧脱位，脱位后屈曲膝关节，打开关节囊，于关节腔内准确定位前交叉韧带，体式显微镜下用显微剪离断前交叉韧带，止血并关闭手术创口。术后连续3 d青霉素0.4 MU/d肌注，预防感染。置于标准动物饲养笼中允许其自由活动及进食，无特殊干预下继续饲养4周。

2.2 组织学观察

造模成功及给药干预结束后，解剖各组实验小鼠的右侧膝关节。保留部分股骨及胫骨平台，取下完整的膝关节后4%多聚甲醛固定，脱钙液脱钙，二甲苯透明后制作厚度为5 μm的石蜡切片，苏木精-伊红染色(HE染色)，生物显微镜下观察后进行Mankin's评分。

2.3 免疫组织化学

保留部分股骨及胫骨平台，取下完整的膝关节后4%多聚甲醛固定，脱钙液脱钙，二甲苯透明后制作厚度为5 μm的石蜡切片。将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的染色盒内，放至微波炉中，中高火档至加热10 min，将染色盒取出浸入流水中。自然冷却后用PBS浸洗3次。每张切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室温(15 ℃～25 ℃)封闭10 min。PBS浸洗3 min×3次，滴加1%BSA 50～100 μL,室温孵育20 min。甩去，不洗。滴加一抗50～100 μL，4 ℃过夜。PBS浸洗3 min×3次。滴加增强剂50 μL，室温湿盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次。

一抗二抗反应：滴加通用型鼠/兔聚合物50 μL，室温37 ℃湿盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次。每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液。镜下观察染色深浅，染好立即终止,用自来水轻柔冲洗15 min用蒸馏水终止显色反应。将切片放入苏木素染液，染色10 min，用蒸馏水冲洗干净。如染色过深，可用0.1% HCl分化，自来水冲洗后返蓝。分别用70%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；无水乙醇乙醇中浸泡5 min。用二甲苯浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。在切片上加中性树胶，加盖玻片。光学显微镜下观察组织细胞中蛋白的表达情况，取3个高表达区域拍照保存(所有图片均400倍拍摄)。

2.4 酶联免疫吸附检测

造模成功及给药干预结束后，眼球取血1.5 mL，静置后离心(4 ℃，2 000 r/min，30 min)，吸取上层血清，并分装于离心管中，-80 ℃保存。按照酶联免疫吸附检测试剂盒使用说明书检测各组血清中VEGF，MMP13的含量。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 软骨组织学观察及Mankin's评分

假手术组(A组)的小鼠膝关节软骨表面光滑，细胞排列规则，潮线完整，结构清晰，染色正常；模型组(B组)的小鼠膝关节软骨表面不完整，可见部分软骨脱落，未见清晰的软骨结构及潮线；高剂量组(C组)小鼠膝关节软骨面光滑完整，局部深染，无软骨断裂及剥脱，潮线连续度尚可；低剂量组(D组)小鼠膝关节软骨表面连续，软骨结构较清晰，染色尚可，潮线模糊，有轻度失染；阳性药(美洛昔康)组(E组)小鼠膝关节软骨表面光滑度尚可，局部修复，未见明显软骨断裂及剥脱，重度深染，潮线模糊。见图1。

图1 温经通络汤干预2周后各组小鼠膝关节软骨HE染色(×400)

膝关节软骨的Mankin's评分显示：与假手术组相比，其余各组的评分均明显升高(P<0.05)，与模型组相比，高剂量组、低剂量组、阳性药组的评分则明显下降(P<0.05)。高剂量组的评分低于低剂量组和阳性药组(P<0.05)，低剂量组与阳性药组的评分无统计学差异。结果见表1。

表1 各组膝关节软骨的Mankin's评分比较分)

3.2 ELISA检测血清中VEGF、MMP-13表达

ELISA检测结果显示，造模成功并干预2周后，与假手术组相比，其余各组的小鼠血清中VEGF及MMP-13表达均有明显升高(P<0.05)，其中模型组小鼠血清中VEGF及MMP-13的表达最高，高剂量组、低剂量组、阳性药组与模型组相比均有下降(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组血清中VEGF、MMP-13表达情况比较

3.3 免疫组织化学检测各组小鼠膝关节软骨中的VEGF, MMP-13及HIF-1α的表达

造模成功并干预2周后，高剂量组、低剂量组和阳性药组中小鼠膝关节软骨中的VEGF表达相较于模型组组均有明显下降，其中阳性药组的表达最低，接近于假手术组的水平。低剂量组、高剂量组和阳性药组的VEGF表达呈递减趋势。该部分实验证实了中药复方温经通络汤在治疗膝关节骨性关节炎的过程中，对膝关节中存在的血管新生与侵袭的确存在抑制作用。其可通过抑制膝关节中VEGF的表达，从而减慢膝关节内骨-软骨交界处的血管新生和向软骨内侵袭的过程。见图2、图3和表3。

图2 免疫组化检测各组小鼠膝关节软骨中VEGF的表达(×400)

表3 各组小鼠膝关节软骨中的VEGF,MMP-13及HIF-1α表达比较

图3 小鼠膝关节软骨中的VEGF表达比较

造模成功并干预2周后，高剂量组、低剂量组及阳性药组中小鼠膝关节软骨中的MMP-13表达相较于模型组均有明显下降，其中阳性药组小鼠膝关节软骨中的MMP-13表达最低，接近于假手术组的水平。低剂量组、高剂量组、阳性药组的MMP-13表达呈递减趋势。该部分实验表明，中药复方温经通络汤在治疗KOA的过程中，可有效降低MMP-13的表达，MMP-13不仅可以降解软骨中的Ⅱ型胶原蛋白，还可以降解软骨中的蛋白多糖，IV型和X型胶原蛋白，骨黏连蛋白和基底膜蛋白聚糖，其在KOA中扮演着重要角色[2]。而温经通络汤可以通过抑制MMP-13的表达，从而达到维持膝关节内生理环境的平衡，进一步延缓膝关节内关节软骨的退变。见图4、图5和表3。

图4 免疫组化检测各组小鼠膝关节软骨中MMP-13的表达(×400)

图5 小鼠膝关节软骨中的MMP-13表达比较

造模成功并干预2周后，模型组小鼠膝关节软骨中的HIF-1α含量相较于假手术组有明显升高(P<0.01)，高剂量组、低剂量组及阳性药组小鼠膝关节软骨中的HIF-1α含量均高于假手术组且低于模型组(P<0.05)。低剂量组、高剂量组及阳性药组小鼠膝关节软骨中的HIF-1α含量呈递减趋势(P<0.05)。该部分实验证实，中药复方温经通络汤在治疗膝关节骨性关节炎过程中，可有效抑制关节表面软骨内HIF-1α的表达，由于VEGF是HIF-1α调节的靶基因，所以温经通络汤可通过抑制HIF1α的表达，从而达到减缓血管新生的目的。见图6、图7和表3。

图6 小鼠膝关节软骨中的HIF-1α表达比较

图7 免疫组化检测各组小鼠膝关节软骨中HIF-1α的表达(×400)

4 讨论

温经通络汤是黄桂成教授结合数十年临床经验，经过不断调整、优化后总结出的经验方。方中附子、桂枝温经散寒、通络止痛；熟地黄养血滋阴、生精益髓；土茯苓、泽泻利水除湿解毒、通利关节；陈皮化痰理气；胆南星熄风定痉；延胡索活血行气止痛；全蝎、蜈蚣搜风通络、熄风止痛、解毒散结；怀牛膝引药下行，补肝肾、强筋骨；甘草调和诸药。此方针对膝骨关节炎的致病因素，从风、寒、湿三邪入手，以祛风、散寒、化湿等为治疗原则，以温经散寒，搜风通络为治疗方法，在临床应用中取得了立竿见影的效果。

膝骨关节炎属于骨痹范畴，如《素问·灵枢》[3]曰：“痹在于骨则重……在于筋则屈不伸。”膝骨关节炎是影响中老年人群工作生活的常见病症，其主要症状包括局部疼痛，活动受限，关节肿胀、变形等。该疾病的发生发展过程中伴随着软骨的破损、增生、缺失等一系列的病理改变[4]，在发生病变的软骨中血管侵袭起到了不可忽视的作用，新生血管可进一步加重软骨结构的破坏，而血管生长因子(VEGF)则起到了促进血管新生的作用，因此通过抑制VEGF的表达，可有效减缓软骨内血管侵袭的速度，从而达到保护软骨形态，减轻膝骨关节炎症状的效果[5]。骨关节炎机制研究中发现，血管侵袭是软骨破坏的始动环节，早期抑制血管侵袭可以阻止骨关节炎发展[6]。软骨组织受刺激分泌血管内皮生长因子(VEGF),早期诱导内皮细胞增殖并向软骨区定向移动，软骨组织受刺激分泌基质金属蛋白酶-13(MMP-13)等蛋白酶，进一步为血管侵袭开辟组织间隙[7]。VEGF可能是炎症新生血管的关键调节因子，VEGF诱导内皮细胞增殖迁移和刺激血管生成[8]。Cécile Lambert等[9]研究膝关节骨性关节炎的滑膜组织标本16例，通过组织学和免疫组化实验，滑膜细胞分离培养、DNA分析以及IL-6、IL-8、VEGF、TSP-1和VEGI的免疫测定，对不同程度的滑膜血管生成和炎症关系进行研究。免疫组化研究显示KOA滑膜的内皮细胞密度和VEGF免疫反应性增加，对应着炎症级别和巨噬细胞浸润增加。TSP-1作为血管生成抑制剂，过表达会降低炎症和血液滑膜血管密度。巨噬细胞在内皮的迁移是血管生成的关键步骤之一。巨噬细胞通过促血管生成因子和细胞外基质重塑促进血管生成。Tibesku等[10]建立了前交叉韧带(anterior cruciate ligament, ACL)切断的兔膝关节KOA模型，提取关节软骨进行组织学和免疫组化研究。实验显示KOA关节软骨细胞内VEGF 高表达。Lambert 等[11]采集了接受全膝关节置换术(total Knee Arthroplasty, TKA)的KOA 患者的滑膜组织，检测VEGF 在内的多种细胞因子水平。实验证实VEGF 和 KOA 的发生及进程密切相关。Saetan 等[12]和Hoff 等[13]采集KOA 患者的组织液：血浆、膝关节液、滑膜和软骨，并检测各种细胞因子水平。实验证实关节液和滑膜组织中，包括VEGF在内的多种 PIC 水平相较于血浆显著升高。Chen等[14]将大鼠关节软骨细胞以单层培养，通过RT-PCR和WB实验，表明VEGF可能通过抑制聚集蛋白聚糖和II型胶原的合成和表达而导致关节软骨退化。VEGF 是血管生成的重要参与者，是血管内皮细胞形成的启动者。VEGF 的表达受多个基因的调控，HIF-1α是调控VEGF表达最主要的基因[13]。

通过以上的实验结果可以看出温经通络汤可有效抑制HIF-1α的表达，从而进一步调控VEGF的表达，延缓血管侵袭软骨的进程，以达到减轻炎症反应，减缓软骨退化，修复软骨缺损，维持软骨完整性，改善关节生理功能的目的。