p16/ki-67双重染色在宫颈癌筛查中的应用分析

叶静，王炯，刘晓清，卜相冉

(1. 长治医学院，山西 长治 046000；2.山西省长治医学院附属和济医院妇科，山西 长治 046000)

1 宫颈癌病变机制

宫颈癌作为我国女性常见恶性肿瘤之一，其发病机制复杂多样，研究证明，高危型HPV持续感染是导致宫颈癌的主要病因，其可能发生的机制为：高危型HPV在持续感染宫颈上皮细胞的过程中, 将病毒DNA通过非同源重组的方式整合到宿主细胞基因组,大量转录两个主要致癌基因E6、E7的mRNA,导致HPV E6/E7癌蛋白高表达，两种蛋白以协作的方式引起上皮细胞永生化，而这是肿瘤恶变的前提。深入研究发现[1]，E6和E7蛋白转化细胞的能力在一定程度上与另外两种细胞内蛋白P53蛋白和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)相互作用有关；相关具体机制将在下文详细阐述。

2 p16/ki67双重染色用于宫颈癌筛查或诊断的原理

2.1 p16基因分析

2.1.1 p16基因特点

l994年Kamb[2]等人首次提出并报道了pl6基因，该基因是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitorCKIS)家族成员，定位于人第9号染色体短臂2区l带(9p2l)，可编码多种蛋白，其中p16INK4a蛋白作为其编码产物之一，主要在细胞核内发生作用，包括直接参与细胞周期的核心调控，促进细胞分裂停止，终止细胞生长，另一方面，进一步诱导生长细胞发生凋亡，从而发挥抑癌基因的作用。在人体内，p16基因的作用主要为以下几个方面：①在细胞周期中，p16负调控pRb-E2F通路；②p16基因产物p16INK4a蛋白可与细胞周期蛋白D(Cyclin D)竞争性结合细胞周期依赖性激酶(Cell cycle dependent kinase：CDK)CDK4/6，干扰CDK4/6与细胞周期蛋白D的结合，阻止细胞从G1期发展至S期，抑制细胞增殖，防止恶性变；③与JUNK1/3相互作用，抑制其激酶活性；④随着细胞衰老p16相关蛋白会异常增加，高水平的p16相关蛋白会诱导干细胞及癌前肿瘤细胞衰老。

2.1.2 p16基因与肿瘤关联性在人体内，多种因子参与抑癌基因

和癌基因相互作用，保证机体内部处于相对平衡状态。p16基因是人们发现的第一个直接作用于细胞周期、抑制细胞分裂的基因，作为一种抑癌基因与许多种恶性肿瘤的发生和发展均有关系，所以也称为多重肿瘤抑制基因。正常细胞内存在p16-CyclinD-pRb通路，该通路可维持正常细胞周期进行，其中，CyclinDl与CDK4、CDK6形成的复合物，促进细胞内的Rb磷酸化，使与Rb结合的转录因子(Transcription factor)E2F释放，E2F可使细胞周期继续进行，当细胞受损或 DNA异常时，pl6与CyclinD竞争结合CDK4，从而抑制Rb磷酸化修饰，使转录因子E2F无法解离出来而抑制细胞周期进程，阻止不正常细胞进入细胞周期，最终抑制细胞的增殖和恶性转化；当pl6发生基因缺失、突变或甲基化等机制导致通路下调使pRb失活而不能正常表达时，突变的Rb基因编码的蛋白质不能与E2F结合，使其能够不断启动基因表达合成大量的DNA聚合酶，促进细胞分裂，导致细胞周期发生紊乱而引起癌变[3]，因此有研究显示许多恶性肿瘤都存在p16基因表达异常，进一步研究还显示p16-CyclinD-pRb通路中多种因素所导致E2F过度活化是肿瘤细胞周期中该通路负反馈调节通路异常的核心机制，也是恶性肿瘤发生和演进的重要早期分子事件[4]，提示该通路的异常在宫颈病变中也可能会发生。

2.1.3 p16基因与宫颈病变的关联

在宫颈从正常组织进展为癌组织的漫长过程中，抑癌基因表达失活和癌基因的表达激活是其细胞癌变的分子基础。在正常情况下，根据p16在细胞中的作用机制，若细胞出现过度生长，该基因应出现表达下调的现象，但在对宫颈癌机制的研究中发现，在宫颈病变细胞中，p16基因不存在低表达或者是基因的失活现象，相反，pl6基因在宫颈癌组织以及高度内皮瘤样组织中出现过表达，部分研究证实，存在这种现象的主要原因可能是：HR-HPV E7癌蛋白可结合pRb-E2F通路中的磷酸化Rb(pRb)，使其磷酸化失活，导致了pRb-E2F复合物分离，游离E2F增加，促进了肿瘤细胞的过度增殖，同时pRb-E2F复合物的浓度持续性降低，解除了对pl6基因表达的负反馈抑制，从而导致了pl6基因的过表达[5,6]；因此，当宫颈细胞化学免疫染色出现p16高表达，强烈提示宫颈已发生病变，部分研究证实，p16蛋白在子宫颈炎症、鳞化、萎缩、不成熟化生、移行细胞化生、修复性改变等组织当中并无阳性表达或是仅为微量表达，在纤毛细胞及未成熟鳞化细胞中意外表达；随着宫颈病变程度的加重，p16INK4a蛋白在组织学发展过程中的阳性表达程度逐渐增强[7]，Tian Q等[8]研究p16INK4a在宫颈鳞癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达时发现，p16INK4a在鳞癌组织CIN中有丰富的表达，而在正常宫颈组织中不表达；Grace D等[9]在研究HR-DNA感染的宫颈鳞癌中也存在p16的过表达现象。

2.2 ki-67抗原分析

2.2.1 ki-67抗原特点

该抗原首先从淋巴瘤L428细胞系中发现，1983年，由Gerdes 等人[10]在增殖细胞中对Ki-67抗原进行鉴定，表明Ki-67抗原是一种与核糖体RNA转录相关非组蛋白性核蛋白(Nonhistone nucleoprotein)，该蛋白由MKI-67基因编码，定位于人体第10号染色体上，基因全长分别为11.5 kb和12.5kb，由15个外显子组成，ki-67蛋白组成包括两条相对分子量分别为395 kD和345 kD的多肽链组成，有两种变异体。ki-67主要维持细胞增殖，因此其Ki-67标记指数更多被应用于肿瘤细胞状态的监测。

2.2.2 ki-67抗原与肿瘤的关联

Ki-67抗原在增值活跃的细胞中全程均有表达，而在细胞静止期不表达，当细胞进入周期后，开始表达于Gl期，在S期及G2期表达逐渐增加，至M期达高峰，在分裂晚期很快消失[11]；作为反映肿瘤细胞增殖活性和细胞周期进行状况的一个重要指标，ki-67最早用于评估乳腺癌的分级与预后，后也用于神经系统肿瘤中，通过计算Ki-67指数，在肿瘤细胞中，该指数越高，提示恶性程度越高，预后越差[12]；另一方面，ki-67半衰期短，在细胞分裂结束后迅速降解，但在恶性肿瘤细胞中，因其恶性增值，导致ki-67持续表达，使其能较好的反映肿瘤的恶性程度及患者的预后。Filippella[13]等通过研究发现，ki-67可很好的预测肿瘤侵袭、复发，且将肿瘤是否发生生物学改变的阳性和阴性临界值设定为ki-67LI(ki-67 Labling index，ki-67LI)＞2.9%，可得到较高的敏感性及特异性；且在肿瘤细胞的增殖活性评估中，当ki-67蛋白表达越高时，患者死亡风险也相应升高[14]。

2.2.3 ki-67抗原与宫颈病变的关联

研究发现，ki-67并不直接参与宫颈癌发病的核心机制，但在对宫颈病变进行研究时，发现随着宫颈病变程度加重，其检出率越高。一项关于50例老年宫颈癌手术患者研究结果显示[15]，ki-67蛋白无阴性表达，且以强阳性表达占比最高，其次为中等阳性、弱阳性，经生存函数分析后发现，ki-67蛋白高表达患者死亡风险高，预后差，该结果与多数研究基本一致[16]，结合前面所诉，提示ki-67蛋白在宫颈病变中，随着病变程度的加重，其表达也相应增加，可应于宫颈癌病变的筛查及宫颈癌手术患者预后的评估；并且研究还显示，其高表达可能是患者不良预后的独立影响因素。

2.3 p16、ki-67联合应用

在我国宫颈癌筛查中，目前主要为宫颈细胞学涂片联合HPV-DNA筛查，两者联合应用部分弥补了细胞学涂片存在的高假阴性率及HPV-DNA检测的高假阳性率等诸多问题，但在初筛后的分流中仍存在不能很好区分高低级别病变的弊端，导致患者诊疗过度或重视不足；而p16/ki-67双重染色因其在宫颈癌筛查中有较好的分流作用近年来被多数学者研究。在正常细胞中，p16基因表达可以抑制细胞周期，使细胞不会出现过度分裂，而Ki-67过表达提示细胞在大量或无限增值，两种基因过表达提示细胞完全相反的两种生长状态，因此，不会同时出现过表达，若p16及Ki-67基因同时过表达，强烈提示细胞周期失调已导致宫颈发生病变[17]；因此将其作为宫颈上皮细胞的生物学状态评估指标，可部分弥补液基细胞学和HPVDNA检测的不足；在双重染色的发展过程中，初始是对p16表达蛋白进行单一检测，但在应用过程中，一些研究显示细胞学标本中p16INK4a非特异性染色太强，最高甚至可达80%以上，导致细胞是否发生病变难以区分，加之免疫化学染色本身也会出现部分假阳性及假阴性，从而限制了其临床应用，而Ki-67在染色上虽然误差较小，但在计算结果方面，由于检测方法目前尚未做到标准化，不同医疗机构、不同的实验室诊断结果的一致性、可重复性较差，也部分限制了Ki67在临床上的进一步应用；因此，部分研究学者将目光转向将两者联合应用，多项研究证实了其有效性；李萱[18]等对1002名性宫颈筛查患者研究显示：p16/ki-67单一的筛查在特异性和敏感性方面均低于联合筛查；还有研究指出，p16对HSIL诊断敏感度、特异度虽然较高，但对LSIL行p16单独检测，存在漏诊现象，建议联合Ki-67增强检出率[19]，特别是使用p16INK4a/Ki-67双染色细胞学(CINTEC PLUS®，罗氏诊断公司)的HPV-DNA检测和分选最近被证明是目前较为准确的宫颈癌筛查算法[20]；欧洲一项对27349名女性行宫颈癌筛查的大型横断面临床研究[21]也显示p16/ki-67双染检测诊断CINII和CINIII的灵敏度均较高；而Wentzensen等人[22]对1509例HPV感染阳性的妇女进行双重染色的效果评估中也发现：双重染色阳性率随着细胞学严重程度的增加而增加；研究还显示p16/Ki-67双重免疫染色可能在ASC-US和低级别鳞状上皮内病变(LSIL)分诊中有重要的预测作用[23]；p16/Ki-67双染还可以检测宫颈组织细胞的致癌变化，同时可进行低级别病变及以下的分诊[24,25]。另一方面，细胞形态学对p16/Ki-67双染表达无影响，且操作人员主观经验对双染结果影响较小，即使无相关经验医师在经过培训后也可进行阅片操作，Duan LF等[26]通过对902名女性进行宫颈癌筛查，在对实验结果进行判读时显示：两位细胞病理学医师对p16INK4a和TCT判读的kappa值[kappa值：即内部一致性系数(inter-rater, Coefficient of internal consistency)，是作为评价判断的一致性程度的重要指标。当计算结果在0.81～1区域时提示几乎完全一致]的高度符合，提示p16INK4a染色结果的判读在宫颈病变诊断和/或筛查中可以减少被病理医生主观因素的影响的优势性。美国阴道镜及子宫颈病理协会(American Society for Coposcopy and Cervical Pathology, ASCCP)[27]将p16/ki-67双重染色纳入宫颈筛查，表明此种筛查方法有不同于其他筛查方式的优势及研究前景，大多数研究对于此种筛查进行大量临床实验来证明它的有效性，但大多数的研究均为小数据研究，受地域、医疗水平等限制，所得到临床数据并不能代表我国大概的真实情况，因此该项筛查在实际临床中并未得到广泛的应用，而且有部分专家认为，截至目前为止，并未发现任何联合标记物较单独使用p16能实质提高诊断准确率，仅仅在p16无法确定或技术上不充分的情况下，可考虑联合应用ki-67和/或Pro Exc IHC。因此，我们需要多方面综合的查阅大量数据进行汇总，从而得到一个更贴近真实情况的数据，进一步探索p16/Ki-67在宫颈癌筛查方面的应用价值。

3 p16/ki-67双重染色在SIL中的应用

3.1 适应证及禁忌症

适应证：①HSIL(CINII/III级)及良性相似病变；②可疑HSIL(CINII)或LSIL；③细胞学倾向HSIL而组织学LSIL或阴性；④HSIL鉴别诊断存在争议；禁忌证：①形态学上明确的良性病变，明确的CINI、CINIII级宫颈鳞状上皮内瘤变；②LSIL与宫颈良性病变的鉴别(炎症及鳞状上皮反应性改变)。

3.2 p16/Ki-67双染色报告解读

国外学者进行相关研究证实[28]，p16/Ki67双重染色未经正规细胞学形态培训的技术人员经过短期的阅片培训等即可独立完成阅片，并且准确性和重复性都较好，尽管如此，对双染报告的解读仍然受其他多种因素影响，如：标本染色效果、阅片者的学习能力及个人主观因素等，其中p16/Ki67染色弱、细胞形态保存较差以及背景染色强在其中起着中起着重要作用。结果判读如下：①阳性判读：强而弥漫的块状染色，表现为连续性强的核/核+浆染色，且自基底层开始向上延伸至少达全层厚度的1/3；②阴性判读：局灶或斑片状核染色，仅胞浆表达，或仅有散在的单个细胞及其余表达方式；其中，连续块状染色需要足够量的组织，鳞状上皮好的方向性，染色阳性区需与形态怀疑处对应；鳞状上皮染色弥漫阳性的延伸范围并非必须与CIN的级别对应；以下情况：小片组织、斜切、游离漂浮的单个细胞、及其余可能导致更主观及不同诊断医师间分歧的情况，判断为阳性的最低限度为：所有有疑问的细胞均强阳性，同时这些细胞形态学上已列为需与HSIL鉴别。诊断双重染色提高诊断的准确性及不同病理医生间的一致性：使用双重染色可导致约1/3CINII下调至LSIL，对形态学不确定及诊断困难的宫颈病变，尤其对局灶宫颈高级别上皮内瘤变可有辅助诊断作用；结合双染结果，SIL的诊断：①如果染色标本在形态学符合CINII或CINIII级，则p16阳性支持组织学HSIL诊断；②染色结果在形态学上是CIN1，即使p16阳性，也不能升级为组织学HSIL(CINII级)；③极少数HSIL p16为阴性表达，准确诊断必须与形态结合；④部分小片方向性差的活检组织，即使强而弥漫的染色也可能难以评判为阳性。

4 p16/ki-67双重染色方法在宫颈病变筛查或诊断的研究进展

4.1 在ASC-US分流中的应用

对ASC-US进行分流是p16/Ki-67双重染色较早用于宫颈癌筛查的应用，国内外部分学者[29]通过回顾性分析400多例ASC-US病例，将HPVE6/E7mRNA和双重染色对宫颈可疑病变分别进行分析发现，对于宫颈筛查而言，HPVE6/E7mRNA更适合用于宫颈初步筛查，宫颈发生病变初期的基因产物，相较于病毒DNA而言，更能排除一过性的病毒感染，双重染色在ASC-US中的分流作用较为明显，且能与宫颈CINII有高度的一致性，陈飞等[30]回顾性分析了200例液基薄层细胞学检查(TCT) 结果为ASC-US，并行HPVE6/E7 m R NA、p16/Ki-67检测的患者，以阴道镜下宫颈组织活检结果为参照标准，认为HPVE6/E7mRNA检测可望代替HPV-DNA 成为分流ASC-US的一种有效手段，而p16/Ki67双重染色可辅助用于ASC-US患者宫颈组织的病理诊断。Rodens等对p16INK4a免疫细胞化学染色与HC2对ASC-US和LSIL的分流能力的Meta分析其显示对ASC-US和LSIL均有较好的分流作用。

4.2 在CIN分流中的应用

ASCCP建议将新的分级和旧的分级联合应用，在新的分级中，CINII、CINIII级被归类为HSIL，而在新的筛查指南中，HSIL需进一步行宫颈环形电切术或宫颈锥切术，但部分研究发现，CINII中部分为低级别病变，可消退，并不需要进一步诊治，定期随访即可，因此p16 /Ki67双重染色的分流作用就显得尤为重要。Carozzi 等[31]对宫颈HPV感染的妇女进行分流研究发现，P16/ki-67染色阳性患者3年内进展为CINⅢ的风险为4.7%，而染色阴性的患者仅有0.8%发展为CINIII。另外，在一项对中国妇女中进行的大型前瞻性研究发现[32]，p16INK4a在正常组织、CIN1、CIN2、CIN3、宫颈癌中的阳性率分别是2.7%、42.7%、75.5%、79.6%和100%(P＜0.001)，通过对CIN1的患者进行p16/ki67双重染色发现，与染色阴性妇女相比，双染阳性的患者两年后进展为高级别病变的风险是8.25(95% CI：1.02-66.62)，表明p16、ki-67过表达不仅与宫颈病理级别相关，还可对低级别病变进展为高级别病变的风险进行预测。

4.3 在HPV阳性患者的分流

Calleb George Onyango[33]等进行了一项综合性的实验数据结果收集，对HPV阳性妇女进行进一步基于分子标志物的筛查，以宫颈活检结果为最终筛查结果对照，发现CIN2+检测方法的诊断性能为：SCC-Ag：敏感度78.6-81.2%，特异度74-100%。M-CSF：敏感度68-87.7%，特异度64.7-94%；VEGF：敏感度56-83.5%，特异度74.6-96%。microRNA：敏感性52.9-67.3%，特异性76.4-94.4%。p16INKA/Ki-67：敏感性50～100%，特异性39～90.4%。HPVE6/E7/mRNA：敏感度为65-100%，特异度为42.7-90.2%；DNA甲基化：敏感度为59.7-92.9%，特异度为67-98%。提示将该联合筛查作为HPV阳性的分诊方法，可以在一次检测阳性后即转诊阴道镜+宫颈活检；直接接受后续的检查和治疗。Li[34]等通过对21～70 岁参加宫颈癌筛查的妇女及门诊患者共计497例进行 HPV E6/E7m RNA 检测、液基细胞学检测(LBC)与 p16/Ki67 双染对比分析认为，p16/Ki67双染技术用于HPV阳性人群的分流具有优于LBC的特异性和与LBC检测相似灵敏度的特性。Luttmer R等[35]也表明 p16/Ki -67双染能有效提高 CIN≥III 级病变诊断敏感度、特异度，被认为是高危型HPV阳性女性分流手段。综合以上研究不难发现，对于HPV阳性分流的应用大部分研究仍是基于HPV联合TCT初筛为基础的二次分流，而不是将双重染色用于宫颈癌的初筛，该双染在筛查中的应用仍主要用于宫颈上皮内瘤变的分流[36]。

4.4 在宫颈癌治疗和评估的应用

近十年对于p16/Ki67双染的研究，主要是将该筛查用于ASCUS的诊断分流，但随着后续研究，发现该染色在宫颈病变CINII及宫颈癌预后评估中也发挥重要作用。徐又先等在关于宫颈癌的研究中将ki-67与hmsh2联合应用于宫颈癌预后表达的研究，结果表明，在宫颈癌组织中，ki-67的阳性率显著升高，且hM-SH2在Ki-67高度表达者阳性率显著高于Ki-67中度表达者，提示hM-SH2与 Ki-67表达的相关性，hMSH 2阳性表达伴有Ki-67过表达者，其癌细胞增殖活跃，更易发生侵袭转移。虽然根据此研究结果我们并不能看出ki-67在宫颈癌中的具体机制及与hMSH 2相关联程度，但其在宫颈癌的筛查及预后评估中应用价值却值得我们进一步研究，而与p16的联合应用，将使它的应用价值又进一步增加。GuanFY等[37]最新研究，将P16/ki-67双重染色和HPV E6/E7 mRNA检测及其联合应用在低级别鳞状上皮内病变细胞学分流诊断中的价值中发现，该双重染色还可应用于宫颈癌治疗效果及预后的评估指标。

5 展望

子宫颈癌作为最常见的妇科恶性肿瘤之一，其致病机制是一个多因素、多步骤、多阶段、多种癌基因和抑癌基因参与的复杂病理过程，目前病因较为明确，且通过三阶梯筛查可检测出宫颈癌前病变。但在宫颈上皮内瘤变转归的评估中，一个最重要的问题就是预测病变是否有进一步转化恶性的高危风险，以避免不必要的阴道镜转诊，并降低医疗保健成本。目前各种基于HR-HPV的筛查项目考虑的方法多种多样，证明了围绕最佳分诊测试缺乏共识，而积极寻找最佳的筛查和诊断方法，是我们应该积极探索和追求的。p16/ki67双重染色包括细胞学染色及组织学染色，目前主要在宫颈病变分流中被应用，前者包括对ASCUS及HPV阳性的分流，后者则对阴道镜活检后对CIN病变分级不确定的患者进行分流，在临床实际中，双重染色的应用虽已有许多临床数据表明其有效性，但在临床实际应用中仍然缺乏广泛认可，染色的应用范围及普及性仍不确切，需要更多的临床随机对照研究来证明其实用性，且部分研究还显示其在宫颈癌治疗及预后评估方面也有一定指示作用，因此研究p16/ki-67双重染色检测，可以为宫颈癌预测和评估提供更加确切的实验依据。