鳗鱼中氯霉素荧光免疫层析快速检测方法研究

汤轶伟，崔芷萌，刘 欢，吕长鑫，刘秀英，钟克利，汤立军

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；3.渤海大学化学与化工学院，辽宁锦州121013）

0 引言

氯霉素（CAP）是一种酰胺醇类抗生素，白色细针或片状结晶，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂.该药物通过与细菌核糖核蛋白体50S亚基的可逆结合，抑制蛋白合成，实现对肺炎球菌、链球菌、李斯特菌、痢疾杆菌等细菌的广谱抑制［1］.20世纪80年代，我国将氯霉素开始用于水产养殖过程中细菌性疾病的防治.近年来，研究证明氯霉素对人体具有较大的潜在危害，如抑制骨髓造血功能、损伤神经系统引发失眠、幻觉、狂躁等症状［2］.中国、美国、韩国、日本等多个国家规定水产品中不得检出氯霉素［3，4］.鳗鱼鱼肉富含蛋白、脂肪、维生素，二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等营养成分，是我国主要的出鱼种之一，具有重要的经济价值［5］.所以，为保证鳗鱼及其制品质量安全，建立快速、灵敏、便捷的氯霉素检测方法具有重要意义.

目前，微生物检测法［6，7］、高效液相色谱法［8，9］、气相色谱法［10，11］、色谱-质谱联用方法［12，13］、酶联免疫法［14，15］、胶体金免疫层析法［16，17］、电化学检测法［18-21］、荧光检测方法［22］等技术已广泛用于食品中氯霉素残留检测.其中，传统仪器检测方法操作繁琐，检测成本高，难以满足快速、简便和现场检测需求［23］.免疫层析技术具有检测成本低、操作简便、结果判断直观等优点，已成为当前食品安全快速筛查和检测的主要方法［24-26］.本论文以氯霉素单克隆抗体为分子识别元件，以量子点为标记物构建了氯霉素荧光免疫层析试纸，并建立了鳗鱼检测中氯霉素残留的检测方法，为丰富鳗鱼中氯霉素残留快速检测提供了技术支撑.

1 材料与方法

1.1 试剂

七水硫酸锌（99%）、无水氯化锰（98%）、硫化钠（95%）、谷胱甘肽（GSH，98%）、氢氧化钠（96%）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC，98%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，98%）、无水乙醇（95%）购于阿拉丁试剂公司；氯霉素单克隆抗体、氯霉素包被原、羊抗鼠二抗购于山东蓝都生物有限公司；玻纤8964、玻纤GF-08、玻纤KB-50、玻纤CF-50、Millipore90硝酸纤维素膜、Satorius140硝酸纤维素膜、Pall170硝酸纤维素膜、吸水纸H-1购于上海捷宁生物科技有限公司.

1.2 仪器与设备

DZF真空干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；ZF-7型暗箱三用紫外分析仪（上海勤科分析仪器有限公司）；XIR冷冻离心机（美国Themo公司）；SK6210HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；HM3010单维平面点膜喷金仪（上海金标生物科技有限公司）；Vector 22傅里叶变换红外光谱仪（布鲁克仪器公司）；UItima-IV X-射线粉末衍射仪（日本理学公司）；F-7000荧光分光光度计（日立高新技术公司）.

1.3 GSH-Mn-ZnS 量子点（QD）制备

取2.5 mL 0.1 mol/L ZnSO4、1 mL 0.01 mol/L MnCl2、5 mL 0.1 mol/L GSH和41.5 mL超纯水于50 mL三口烧瓶中，混合均匀后用1 mol/L的NaOH溶液将pH值调至11.室温条件，氮气保护下磁力搅拌30 min后，将0.25 mmol的Na2S快速加入溶液，反应20 min后，将溶液温度升至60℃，老化2 h.待溶液温度降至室温后，加入相同体积的乙醇使量子点沉淀，在12000 rpm下离心10 min，去除上清液，所得量子点于真空干燥箱中干燥，于4℃冰箱保存备用.[27]

1.4 Mn-ZnS QD-CAP 抗体偶联物制备

取500 μL Mn-ZnS QD（1.0 mg/mL）和500 μL磷酸盐缓冲液（0.01 M，pH=7.4）于棕色反应瓶中，加入300 μL EDC溶液（0.6 mg/mL）和300 μL NHS溶液（0.5 mg/mL）充分混合后迅速将反应超声分散30 min，然后加入500 μL CAP单克隆抗体（0.1 mg/mL），在室温下磁力搅拌90 min后得到Mn-ZnS QD-CAP偶联物，于4℃保存备用.[28]

1.5 荧光免疫层析试纸条组装

用划膜仪分别将包被原与羊抗鼠二抗固定于硝酸纤维素膜上作为检测线（T线）和质控线（C线），干燥后，在PVC背板上依次粘贴硝酸纤维素膜、释放垫、吸收垫和样品垫（图1）.

1.6 灵敏度

将浓度为1.0 mg/mL的CAP贮备液用0.05%吐温20-磷酸盐缓冲液（PBST）分别稀释成100、150、500、1000 ng/mL的标准系列溶液，将系列标准溶液和量子点标记抗体溶液混合后取200 μL样本垫上，15 min后在365 nm紫外光下观察T线、C线的荧光强度.

1.7 特异性

分别选用氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和加替沙星5种抗生素来进行特异性实验，用PBST缓冲液将此5种药物稀释成浓度为1000 ng/mL的标准溶液，进行试纸条的特异性实验.

1.8 实际样品检测

称取5 g添加了氯霉素标品的鳗鱼肌肉样品（450 ng/g）于50 mL离心管中，均质后加入20 mL乙酸乙酯提取氯霉素，涡旋20 min后于4000 rpm离心5 min，将乙酸乙酯层转移到100 mL圆底烧瓶中.提取2次，合并的乙酸乙酯提取液于40℃旋转蒸发干燥.向悬干的圆底烧瓶内加1 mL甲醇、15 mL正己烷和25 mL 4%的氯化钠溶液复溶残留物，震荡混匀1 min，在5000 rpm下离心5 min，除去正己烷层，再加入15 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，5000 rpm离心5 min，吸取乙酸乙酯层，将其旋转蒸发（45℃，10 min），蒸干后加入1 mL无水乙醇复溶，再加入4 mL PBST后，进行免疫层析检测.

2 结果与讨论

2.1 GSH-Mn-ZnS QD 的表征

通过高分辨透射电镜对制备的GSH-Mn-ZnS QD形貌结构进行了表征.如图2A所示，GSH-Mn-ZnS QD分散性好，粒径分布均一，约4.5 nm，适合用于构建荧光免疫层析试纸条.红外光谱图（图2B）中1637 cm-1和1938 cm-1光谱峰分别为C=O和C-N振动吸收峰，3415 cm-1为-OH振动吸收峰.该结果表明制备的量子点表面有丰富的氨基和羧基，为共价键法标记抗体提供了化学基团.

2.2 量子点标记CAP 抗体表征

量子点标记CAP抗体是荧光免疫层析试纸构建及检测方法建立的关键.量子点标记抗体前后紫外吸收光谱如图3所示，量子点标记抗体前在295 nm左右出现吸收肩峰，偶联抗体后肩峰出现红移现象，这可能是偶联抗体后量子点粒径微小变化造成的.分别吸取一定量的量子点和标记抗体后量子点于试纸条样品垫，15 min后偶联抗体的量子点分别在试纸条的T线和C线出现了荧光条带，这是由于偶联在量子上的CAP抗体与T线的包被原及C线的二抗特异性结合的结果.量子点标记抗体前后的紫外吸收光谱及试纸条验证结果表明，CAP抗体与量子点偶联成功.

2.3 样品垫和NC 膜优化

不同类型样品垫和NC膜对量子点荧光免疫层析试纸条的性能影响较大.实验优化了不同样品垫和NC膜对试纸条T线和C线荧光强度的影响.图4A表明，玻纤GF-08和玻纤KB-50样本垫试纸条的T线、C线荧光强度接近，然而GF-08的层析速度较快.Millipore90、Satorius140和Pall170 NC膜实验结果如图4B所示，Pall170 NC膜层析速度快，且T线、C线的荧光强度较强.所以，本实验玻纤GF-08样本垫和Pall170 NC膜组装试纸条.

2.4 包被原和二抗包被浓度优化

包被原包被于T线的浓度与二抗包被于C线的浓度对试纸条灵敏度影响较大.包被原包被量优化结果如图5A所示，当包被原在T线的包被量为1.0 ng/mL时荧光强度强，包被量为1.2 ng/mL时荧光强度变化不大.图5B为二抗包被量优化结果，当二抗包被量为1.0 ng/mL时，试纸条C线荧光强度强，可满足检测要求.所以，本实验确定包被原和二抗分别在T线和C线的浓度为1.0 ng/mL.

2.5 荧光免疫层析试纸检测限

不同浓度氯霉素量子点荧光免疫层析试纸检测结果如图6所示，当氯霉素浓度为100 ng/mL时试纸条T线荧光强度与空白有明显差别，为目测判断浓度；当氯霉素浓度为150 ng/mL时T线荧光消失.所以，基于GSH-Mn-ZnS量子点标记抗体构建的氯霉素荧光试纸条的目测检测限为100 ng/mL，消线浓度为150 ng/mL.

2.6 特异性

以10倍氯霉素目测浓度的氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和加替沙星用于量子点荧光免疫试纸条的特异性.检测结果如7所示，可见该浓度下所测药物均为阴性结果，表明制备的氯霉素荧光免疫层析试纸条有较好的特异性.

2.7 样品检测

为评估量子点荧光试纸条对鳗鱼样品中氯霉素残留的检测性能，进行了添加回收实验.图8为鳗鱼样品添加浓度为450 ng/g时的检测结果，可见试纸条T线的荧光强度较空白有明显降低.该结果表明，本实验构建的荧光免疫层析试纸条可用于鳗鱼样品中氯霉残留检测.

国家标准GB/T 22959-2008规定了鳗鱼中氯霉素残留的液相色谱-串联质谱法检测方法［29］，检出限为0.1 μg/kg，该方法灵敏度高，所需检测仪器昂贵，不能满足现场快速筛查的需要.基于氯霉素的广谱抗菌特性，宋杰等［30］建立了微生物法检测牛奶中氯霉素残留方法，该方法操作简单，速度快，但多用于氯霉素残留的定性检测.胶体金是目前免疫层析试纸条常用的标记物［17］，与胶体金标记相比，荧光标记免疫层析试纸条的抗干扰能力，灵敏度、稳定性有明显提高［31］.

3 结论

本实验制备的GSH-Mn-ZnS量子点分散性好，粒径约4.5 nm，表面含氨基和羧基，适合与氯霉素单克隆抗体进行偶联，制备Mn-ZnS QD抗体荧光免疫探针.以玻纤GF-08，Pall170 NC膜，包被浓度为1.0 ng/mL构建的荧光免疫层析试纸条灵敏度高、特异性好，检测速度快，可用于鳗鱼中氯霉素残留的快速检测.

随着纳米技术的发展，越来越多的荧光标记物被设计合成，极大促进了荧光免疫层析检测方法的发展，与对应的荧光试纸条读取仪配合建立现场快速定量荧光检测方法，符合该技术发展趋势，适用于基层对食品安全快速检测的应用.