高效液相色谱法测定银杏叶提取物中的黄酮醇苷

杨金鑫，常 薇，刘伶文，王晓军

(西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安 710048)

0 引 言

银杏叶提取物(EGB)为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶经加工制成的提取物[1],EGB的药用价值与应用极为广泛。采用先进的技术、工艺和设备，通过进一步提取、分离和纯化，其药理作用更加明显，除具有显著的拮抗PAF受体[2]外，在抗过敏、保护心脑血管、改善外周血液循环、降低血清胆固醇及辅助抗癌等方面也发挥明显药效，能有效地清除自由基活性[3-4]，被广泛应用于心脑血管、神经等系统疾病的防治和保健[5]。黄酮类化合物是一类种类复杂的天然酚类化合物，广泛存在于植物中[6-7]。银杏叶提取物中的有效成分主要有黄酮醇苷类化合物和萜类化合物[8]，此外还有有机酸类、酚类、聚戊烯醇类等[9]。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在，其中槲皮素、山奈素、异鼠李素为黄酮类化合物的3种糖苷成分[10]。

黄酮类化合物具有很多的药理活性，黄酮类化合物的提取以及测定已经成为当今生物化学和医药学的重要研究领域。测定黄酮类化合物有分光光度法[11-13]、荧光光度法[14-16]、HPLC法[17-18]、毛细管电泳法[19]等。分光光度法利用生成显色络合物的特性测定总黄酮含量，但精度不高；毛细管电泳电化学检测法中，电渗流会因样品组成的改变而变化，从而影响组分分离的重现性；荧光光度法由于使用缓冲液使得测定结果受pH影响较大。而HPLC法具有分离性能好、检测分析速度快、选择性高、应用范围广等优点，已成为黄酮类化合物含量测定的重要方法[20]。

本文通过进一步优化测定条件，建立了高效液相色谱法测定银杏叶提取物中黄酮醇苷类物质中槲皮素、山奈素、异鼠李素含量的方法，该方法不仅可测定银杏叶提取物中黄酮醇苷类物质的含量，还可通过换算系数得到银杏叶提取物中的总黄酮醇苷含量。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪(安捷伦公司)；KQ-250DA型数控超声波清洗器(江苏昆山超声)；HWCL-3集热式恒温磁力搅拌浴(郑州长城科工贸有限公司)；FA1104N型电子分析天平。槲皮素、山奈酚、异鼠李素(标准品，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；银杏叶提取物；甲醇、乙腈(均为色谱纯)；超纯水。

1.2 试剂的制备

1.2.1 样品溶液的准备 准确称取100 mg银杏叶提取物放入100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL甲醇和20 mL、1.5 moL/L的盐酸溶液，超声10 min，然后加热回流2 h，冷却至室温后将溶液转入50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀静置待测。

1.2.2 标准储备液的制备 分别准确称取槲皮素、山奈素、异鼠李素20 mg，经甲醇溶解后转移至100 mL容量瓶中，定容，得到质量浓度分别为200 μg/mL的标准储备液，放置冰箱保存。

1.3 总黄酮醇苷含量的计算

银杏叶提取物中的黄酮类化合物主要以黄酮醇苷的形式存在，通过水解黄酮醇苷转化为苷元，再以槲皮素、山奈素、异鼠李素为对照品通过外标法计算出3种物质的含量。采用换算系数2.57计算总黄酮醇苷的含量以及各成分所占百分比，其中，总黄酮醇苷含量=2.57×(槲皮素含量+山奈素含量+异鼠李素含量)[21]。

2 结果与分析

2.1 流动相条件的优化

选用4种不同的流动相：V(甲醇)∶V(水)=60∶40、V(甲醇)∶V(水)=50∶50、V(甲醇)∶V(水)=55∶45、V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5，对66.67 μg/mL的混合标准溶液在检测波长为370 nm、进样量10 μL、柱温25 ℃条件下进行高效液相色谱分析，结果如图1所示。从图中可以看出，在3种不同流动相下，槲皮素、山奈素、异鼠李素3种物质均能得到较好的分离。然而，加入乙腈的流动相保留时间缩短且峰面积显著增强，测定结果也更加准确，主要是因为甲醇为类质子溶剂，可与黄酮醇苷化合物形成氢键，提高了分离选择性。而乙腈的极性比甲醇小，流动相的极性越小，洗脱能力就越强。所以在加入少量乙腈的情况下，流动相的洗脱能力更强，导致保留时间缩短，因而选用V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5的流动相。

(a)V(甲醇)∶V(水)=60∶40 (b)V(甲醇)∶V(水)=50∶50

2.2 标准曲线以及检测限、定量限的测定

准确移取槲皮素、异鼠李素及山奈素对照品标准溶液，加入甲醇稀释配成一系列不同浓度的标准溶液，并进行色谱分析。以各标准溶液质量浓度(C)为横坐标，色谱峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线。3种物质的标准曲线、相关系数及线性范围如表1所示，将色谱图中保留时间为5.5～6.5 min的基线作为噪声信号，经测定得到检测限(LOD)及定量限(LOQ)。

表1 标准曲线方程及检测限、定量限

2.3 样品的测定

在标准物质测定条件下，即流动相为V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5、柱温25 ℃、检测波长370 nm、进样量10 μL条件下进行色谱分析，色谱流出曲线如图2所示。

(1)—槲皮素;(2)—异鼠李素;(3)—山奈素

根据表1标准曲线求得样品中槲皮素含量为0.98%，异鼠李素含量为0.15%，山奈素的含量为0.001 3%。然后根据换算系数计算得黄酮醇苷含量为2.91%。

2.4 精密度及加标回收率

取1 mL样品溶液加入0.3 mL的标准储备液，进行6次平行实验后分别求出槲皮素、异鼠李素、山奈素的相对标准偏差为0.65%、0.81%、1.61%。三者的相对标准偏差都在2%以下，表明测定结果精密度良好。

在银杏叶提取物样品溶液中分别加入0.3 mL、20 μg/mL，0.6 mL、40 μg/mL，0.75 mL、50 μg/mL的混标溶液，对加入混标溶液后的样品进行测定，通过对比实际测量值和理论值计算加标回收率，结果如表2所示。

表2 加标回收率

在9组数据中，槲皮素、异鼠李素和山奈素的平均加标回收率分别为99.26%、100.1%、100.35%，平均回收率在99%～101%，表明实验检测方法可行，具有较高的测定准确度。

3 结 论

1)V(甲醇)∶V(水)∶V(乙腈)=60∶35∶5的流动相产生的峰形良好，保留时间短，方法简单，测定结果准确。

2)在检测浓度范围内，槲皮素、异鼠李素、山奈素均具有良好的线性关系。通过该法测得银杏叶提取物样品中总黄酮醇苷含量为2.91%，三者的平均回收率分别为99.26%、100.1%、100.35%，相对标准偏差≤2%，满足实验室的测定要求。

3)该方法操作简便，可用于银杏叶提取物中黄酮醇苷类化合物的准确测定，对于银杏叶提取物中黄酮醇苷类化合物的进一步应用和开发提供依据。