艾灸对类风湿关节炎大鼠IL-23/IL-17炎症轴及相关血清炎性因子的影响

郝锋,吴立斌,刘磊,桑佳佳,吴子建,蔡荣林,胡玲,王建珠,王洁,余情,何璐

(1.南京中医药大学针灸推拿学院,南京 210023;2.安徽中医药大学,合肥 230038;3.南京中医药大学第一附属医院/江苏省中医院,南京 210029;4.安徽省中医药科学院针灸经络研究所,合肥 230038)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种高度异质性、慢性、系统性自身免疫性疾病。流行病学调查显示,该病男女患病比率为1:3,30～50岁为发病高峰,中国大陆地区RA患病率为0.2%～0.4%,全球患病率为0.5%～1%,年发病率为20/100万～50/100万人[1]。其主要病理特征为关节受累、增生性滑膜炎、骨与软骨的破坏、关节功能丧失[2],直至残疾,同时还会影响其他器官。其发病机制复杂,治疗方面尚缺乏统一的治疗方案和特异性药物。因此,对RA发病、防治及相关疗法作用机制的研究一直是该领域的热点。研究认为炎性因子水平失调、炎症轴IL-23/IL-17的激活引起的关节炎症反应是 RA发生发展的重要机制之一[3-4],也是RA的治疗靶点[5]。

艾灸作为中医常用外治疗法之一,对RA的疗效明确,笔者前期采用随机对照的方法,比较100例不同疗程隔姜灸对活动期 RA临床疗效的影响,发现隔姜灸60 d治疗对临床症状体征的改善和实验室指标的改善存在明显优势[6-7]。艾灸治疗RA的机制和原理,值得进一步研究。本研究通过观察艾灸对RA模型大鼠血清中白细胞介素(interleukin, IL)-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-a, TNF-α)水平变化的影响,探讨艾灸对RA模型大鼠相关炎性致损因子的干预作用,旨在从分子生物学水平揭示艾灸治疗 RA模型大鼠的作用机制,为提高临床疗效提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性健康SD大鼠40只,由山东省实验动物中心提供[许可证号为 SCXK(鲁)20190003],体质量为(180±20)g,适应性喂养1周后,依照《卫生统计学》[8]随机数字表将实验大鼠随机分为对照组和模型组,并将模型复制成功的实验动物分为艾灸组、药物组、香烟灸组及模型组,每组8只。实验过程严格遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关规定对动物进行处置。

1.2 主要试剂与仪器

大鼠TNF-α ELISA试剂盒(Cusabio,G22018349),大鼠IL-1β ELISA试剂盒(Cusabio,I05018350),大鼠IL-6 ELISA试剂盒(Cusabio,I11018351),大鼠 IL-4 ELISA试剂盒(Cusabio,H30018353),大鼠IL-10 ELISA试剂盒(Cusabio,I11018354);完全弗氏佐剂(Sigma,SLBW7430);雷公藤多苷片(TPT,10 mg/片)(上海复旦复华药业有限公司,190302);纯艾条(直径 0.9 cm,南阳市卧龙汉医艾绒厂);酶标仪(Molecular Devices,型号SpectraMax M2e);RT-6000酶标仪(Rayto生命与分析科学有限公司,中国);JW3021HR离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司,中国);GL-88B漩涡混合器(其林贝尔仪器制造公司,中国);DNP- 9052BS-Ⅲ电热恒温箱(上海三发科学仪器有限公司,中国);微量移液器(Eppendorf,德国)。

1.3 造模方法

本研究采用“病证结合”的造模方法,即风、寒、湿环境因素＋生物因子复合造模方法[9],复制 RA模型大鼠。将大鼠放置在自制铝合金、玻璃造模箱内,超声雾化器控制箱内湿度,加入适量冰块,使箱内环境温度控制在(6±2)℃,湿度 80%～90%,电风扇风力定于高档,时间持续 12 h。所有需要造模的大鼠均放入上述风、寒、湿环境中 20 d(12 h/d)(20:00—8:00)。实验第21天用75%乙醇于大鼠左后足跖部消毒,并注射完全弗氏佐剂0.15 mL/只致炎,建立RA大鼠模型。观察3 d,以24 h出现足踝部急性炎症肿胀,48 h出现继发性全身多发性关节炎,表现为前肢或对侧肢体甚至耳、尾部红肿或炎性结节出现,提示造模成功,造模时间共计23 d。

1.4 分组干预与穴位选取

1.4.1 对照组与模型组

对照组、模型组与艾灸组大鼠做同样抓取、放置于特制悬空木架上,不做其他干预。每次20 min,每日1次,连续15 d。

1.4.2 艾灸组

选取足三里穴(左侧)。根据大鼠穴位图谱[10]作穴区定位,剪去各穴区被毛,标记颜色。模型复制成功后,抓取大鼠置于悬空木架上,使用0.9 cm直径纯艾条距穴2 cm处悬灸,并根据大鼠避让等反应适当调整施灸距离,每日1次,每次20 min,连续干预15 d。

1.4.3 药物组

雷公藤多苷混悬液灌胃给药[11],浓度为1.6 mg/mL,剂量按8 mg/kg,每日1次,共给药15 d,灌药后与艾灸组大鼠做同样抓取、放置于特制悬空木架上。

1.4.4 香烟灸组

模型复制成功后,抓取大鼠置于悬空木架上,选取穴位与艾灸组一致,剪去各穴区被毛,标记颜色。使用0.8 cm直径香烟距穴2 cm处悬灸,并根据大鼠避让等反应适当调整施灸距离,每日1次,每次20 min,连续干预15 d。

1.5 观察指标

1.5.1 关节肿胀度测量

在致炎造模后每 3天,测量各组大鼠的左后足跖的容积,计算各组大鼠足跖肿胀度[12]。

1.5.2 关节炎指数(arthritis index, AI)测定

在致炎造模后每3天观察并记录全身关节病变程度,每3天1次。全身病变按5级评分法评价,根据未注射佐剂的其余 3只肢体的病变程度累计积分,计算出AI。0分,无红肿;1分,小趾关节红肿;2分,趾关节和足跖肿胀;3分,踝关节以下的足爪肿胀;4分,包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来,即为每只大鼠的AI[13]。

1.5.3 组织病理学观察

最后一次治疗次日麻醉大鼠,腹主动脉取血,静置,3000 r/min离心15 min,分离血清于-40℃冰箱保存备用。然后处死大鼠并取左后肢踝关节滑膜组织于福尔马林中固定,石蜡包埋,切片进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色检测。

1.5.4 血清 IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17和TNF-α水平检测

血清样本测定前置室温下复融均匀,取上清液采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定各组大鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17 和 TNF-α的水平。IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-23、IL-17和TNF-α试剂盒均按照说明书规范操作。

1.6 统计学方法

采用SPSS22.0软件进行数据统计。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,各组关节肿胀度、关节炎指数的比较采用两因素重复测量方差分析(two-wayrepeatedmeasuresANOVA),由于干预分组与时间分组存在交互效应,因此比较干预分组的单独效应。根据球形检验(Mauchly’stestofsphericity)采用SphericityAssumed或Greenhouse-Geiser判断干预分组间的差异是否有统计学意义,进一步采用Bonferroni法行两两比较。各组血清炎症因子水平的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐者采用最小显著差异(leastsignificantdifference,LSD)法,方差不齐者采用Games-Howell法进行两两比较,若不符合方差齐与正态分布,采用Cruskal-Wallis秩和检验进行分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠关节肿胀度比较

造模后模型组、艾灸组、香烟灸组、药物组关节肿胀度均较对照组显著升高(P＜0.05),且模型组、艾灸组、香烟灸组、药物组组间对比差异无统计学意义(P＞0.05)。与模型组比较,艾灸组治疗后 3 d、6 d均无显著差异(P＞0.05),治疗 9 d至 15 d,均显著降低(P＜0.05);香烟灸组治疗3 d至15 d,差异均无统计学意义(P＞0.05);药物组治疗3 d至9 d均无显著差异(P＞0.05),治疗12 d、15 d均显著下降(P＜0.05)。与艾灸组比较,香烟灸组治疗3 d、6 d均无显著差异(P＞0.05),治疗9 d至15 d均显著升高(P＜0.05);药物组治疗3 d至15 d均无明显差异(P＞0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠不同时间左后足趾肿胀度比较 (±s,%)

表1 各组大鼠不同时间左后足趾肿胀度比较 (±s,%)

注:与对照组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与艾灸组比较3)P＜0.05

组别 n 造模后3 d 治疗3 d 治疗6 d 治疗9 d 治疗12 d 治疗15 d对照组 8 0.00±0.00 0.00±0.00 0.78±2.21 1.52±2.81 1.99±2.76 1.95±2.70模型组 8 59.58±18.411) 59.58±18.41 58.80±17.47 57.50±15.60 56.82±14.69 55.45±15.21艾灸组 8 61.00±8.551) 54.15±10.02 39.49±9.67 25.03±10.152) 15.74±6.082) 9.33±4.702)香烟灸组 8 56.48±13.821) 55.82±12.84 55.13±12.31 53.19±12.343) 51.27±10.893) 47.91±11.113)药物组 8 53.82±14.581) 47.96±13.08 39.86±9.62 30.32±9.99 20.19±8.942) 16.88±10.722)

2.2 各组大鼠关节炎指数比较

造模后模型组、艾灸组、香烟灸组、药物组 AI均较对照组显著升高(P＜0.05),模型组、艾灸组、香烟灸组、药物组组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。与模型组比较,艾灸组治疗6 d至15 d均显著降低(P＜0.05);香烟灸组从治疗3 d至 15 d,差异无统计学意义(P＞0.05);药物组从治疗6 d至15 d,均显著下降(P＜0.05)。与艾灸组比较,香烟灸组治疗3 d,差异无统计学意义(P＞0.05),从治疗6 d至15 d均显著升高(P＜0.05);药物组从治疗3 d至15 d均无显著差异(P＞0.05)。详见表2。

2.3 各组大鼠左后肢滑膜组织病理变化比较

对照组大鼠关节滑膜衬里层细胞多呈单层,排列规则,滑膜表面光滑整齐无炎性浸润。模型组大鼠滑膜组织中有大量炎性浸润表现,滑膜表面不整齐,滑膜增生变厚。艾灸组、药物组和香烟灸组滑膜组织中的炎性浸润和滑膜增生变厚现象不同程度缓解,其中艾灸组和药物组滑膜层数减少最为明显,香烟灸组的炎性浸润和滑膜厚度缓解不明显。详见图1。

表2 各组大鼠不同时间关节炎指数比较 (±s)

表2 各组大鼠不同时间关节炎指数比较 (±s)

注:与对照组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与艾灸组比较3)P＜0.05

组别 n 造模后3 d 治疗3 d 治疗6 d 治疗9 d 治疗12 d 治疗15 d对照组 8 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00模型组 8 8.25±0.711) 8.25±0.71 8.38±0.92 8.88±0.64 9.00±0.54 9.13±0.64艾灸组 8 8.25±1.171) 7.13±1.13 6.00±0.762) 4.75±0.892) 3.75±1.172) 3.38±0.922)香烟灸组 8 8.50±1.071) 8.63±1.19 8.88±1.003) 8.25±0.893) 8.13±0.843) 8.00±1.073)药物组 8 8.88±0.841) 8.13±0.84 6.63±0.522) 5.63±0.742) 5.00±0.772) 4.38±0.742)

图1 各组大鼠关节滑膜组织病理比较(HE,×200)

2.4 各组大鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的水平比较

与对照组比较,模型组大鼠血清 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均有显著上升(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均显著降低(P＜0.05),提示 RA模型大鼠处于炎性反应状态;与模型组比较,艾灸组 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著降低(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均出现升高(P＜0.05),药物组 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著降低(P＜0.05),IL-4、IL-10水平均出现升高(P＜0.05),香烟灸组 IL-6、IL-1β水平降低(P＜0.05), TNF-α水平差异无统计学意义(P＞0.05),IL-4、IL-10水平差异无统计学意义(P＞0.05),提示艾灸组与药物组均可降低实验性RA模型大鼠血清中促炎性因子的水平,提升抑炎因子的水平,而香烟灸组对促炎因子 IL-6、IL-1β有抑制作用,对 TNF-α无抑制作用,对 IL-4、IL-10无提高作用;与艾灸组比较,药物组IL-6的水平有显著降低(P＜0.05), IL-1β水平升高(P＜0.05),TNF-α水平差异无统计学意义(P＞0.05),IL-4、IL-10均显著降低(P＜0.05),香烟灸组 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均显著升高(P＜0.05),IL-4、IL-10均显著降低(P＜0.05),提示艾灸组在降低 IL-1β水平优于药物组,而药物组在降低IL-6水平方面优于艾灸组,此两者在降低 TNF-α、提高IL-4、IL-10水平方面无统计学差别,艾灸组在对以上抗炎、抑炎因子水平调节均优于香烟灸组;与药物组比,香烟灸组 IL-6水平显著升高(P＜0.05),IL-1β水平升高(P＜0.05),TNF-α水平差异无统计学意义(P＞0.05),IL-4水平显著升高(P＜0.05),IL-10显著降低(P＜0.05),提示药物组在降低促炎因子 IL-6、IL-1β,提高抑炎因子IL-10水平方面均优于香烟灸组,对 TNF-α水平影响无统计学差别,而香烟灸组在提高抑炎因子IL-4水平方面优于药物组。详见图2。

2.5 各组大鼠血清IL-23、IL-17水平比较

模型组大鼠血清IL-17水平较对照组显著升高(P＜0.05),艾灸组较模型组显著降低(P＜0.05),药物组较模型组略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05),香烟灸组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05);模型组大鼠血清IL-23较对照组显著升高(P＜0.05),艾灸组低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05),香烟灸组、药物组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05),均高于艾灸组(P＜0.05)。详见图3。

3 讨论

中医学认为类风湿关节炎多因平素营卫俱虚、气血不足、脾肝肾亏虚,易感风寒湿热等外邪,病久痰浊瘀血胶着,进一步加重内虚,导致虚实夹杂,缠绵难愈。古今医家多用艾灸治疗本病,如《扁鹊心书》有“痹病走注疼痛,或臂、腰、足、膝拘挛,两肘牵急,于痛处灸五十壮自愈”的记载。《本草纲目·卷十五》认为“艾叶生则微苦太辛,熟则微辛太苦,生温熟热,纯阳也。

图2 各组大鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α水平比较

图3 各组大鼠血清IL-23、IL-17水平比较

灸之则透诸经,而治百科病邪,起沉疴之人为康泰,其功亦大矣”。研究表明,艾灸有抗炎、镇痛、调节代谢和调节免疫等作用,可明显减轻炎性肿胀,提高痛阈[14-15],有效改善RA临床症状及相关理化指标[16-18]。临床观察发现,RA患者的关节疼痛肿胀症状与其相关促炎性细胞因子水平成正相关[19]。

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts, RASF)过度增殖,在 RA发病机制中具有重要作用。RA早期 T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞被活化,释放细胞因子,包括IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-17、IL-23和TNF-α等细胞因子[20-23],进一步激活 RASF。RASF具有类似肿瘤细胞的特性,在关节滑膜中急剧增殖且很少发生凋亡,导致滑膜组织的厚度从正常的1至2层细胞厚增生为10至20层细胞厚,最终引起关节软骨及骨骼破坏,导致患肢残疾和全身并发症[24]。

IL-1包括IL-1α、IL-1β、IL-18等,是自身免疫反应的主要介质之一,可参与炎症细胞的活化,使 RA中慢性炎症持续存在[25]。IL-1协助活化的炎症细胞向病变关节移动,是介导RA中骨与软骨组织破坏及影响骨与软骨修复的关键分子之一。IL-6能增强IL-1和TNF-α等细胞因子的促炎效应,并可诱导 IL-1、IL-17的产生[26],因此IL-6可增加RA患者关节骨质破坏[27]。TNF-α主要由巨噬细胞分泌,可在IL-6、IL-17等细胞因子参与下,由 NF-κB介导产生,Wang M等[25,28]发现TNF-α可引起 Beclin-1过表达,诱导自噬相关基因的活化并启动自噬,并进一步诱导单核细胞分化为成熟的破骨细胞,增强破骨细胞的再吸收能力,造成关节处骨质被吸收。此外TNF-α的表达还与RA的糖、脂代谢紊乱密切相关[29]。研究表明抑制 IL-1β[30]、IL-6[31]、TNF-α[32]等细胞因子的表达可调节RA炎症反应、糖代谢与脂代谢紊乱,而艾灸可显著下调炎症机体IL-1β[33]、IL-6[34]、TNF-α[35]水平发挥抗炎作用。IL-17由Th17细胞分泌后可通过 NF-κB信号通路介导上述IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子的表达而进一步加重炎症反应,致使关节水肿,滑膜增生[36]。IL-17的生成有赖于IL-23的表达,IL-23是一种主要由巨噬细胞、树突状细胞分泌的炎性因子,可通过 STAT3信号通路介导IL-17的产生,并能够放大和维持IL-17的释放[37],同时 IL-17又能正向调节 IL-23的表达,使炎症轴IL-23/IL-17活性增强,进一步激活RANKL/RANK通路,增加破骨细胞数量,在RA后期使关节骨组织受到破坏,使病情恶化[38],研究表明 RA大鼠血清中 IL-23、IL-17水平均较健康大鼠显著升高[39],抑制 IL-23、IL-17的表达能够降低NF-κB与RANKL通路活性,改善RA病情[40-41]。

本研究发现艾灸“足三里”可显著缓解 RA大鼠足跖肿胀与炎症反应,改善局部组织炎性浸润与滑膜增生。从时间维度上来看,从治疗6 d至9 d开始,艾灸对RA大鼠的抗炎消肿作用初步显现,从6 d至15 d治疗结束,艾灸均可持续发挥作用,雷公藤多苷片也有相似的效果,两者抗炎消肿作用相似,但艾灸改善炎性浸润与滑膜增生的效果优于雷公藤多苷片,香烟灸抗炎消肿、改善炎性浸润与滑膜增生的作用较弱。艾灸“足三里”可使 RA模型大鼠血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-23、IL-17水平均下降,IL-6和 TNF-α的水平下降较IL-1β更为显著,并且IL-4、IL-10的水平均升高。这些结果提示,降低机体促炎性因子 IL-6和TNF-α的水平,降低 IL-23/IL-17炎性轴活性,提高抑炎因子IL-4、IL-10的水平可能是艾灸治疗RA的效应机制之一。基于此,笔者认为艾灸可能通过降低RA大鼠促炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,下调炎症轴IL-23/IL-17活性,提高抑炎因子IL-4、IL-10的水平,发挥治疗 RA的生物学效应。有研究表明,炎症轴IL-23/IL-17与 JAK-STAT和 NF-κB信号通路密切相关[42],关于细胞因子在艾灸治疗RA的过程中发挥的作用及细胞自噬蛋白的表达和相关通路可能在艾灸治疗RA中具有一定的作用,值得进一步深入研究和探讨。