内质网应激及其与肿瘤能量代谢关系的研究进展

苏天宇， 黄滔， 吴志浩

（1.皖南医学院临床医学院， 安徽 芜湖241002； 2.肿瘤微环境研究室； 3.基础医学院）

内质网 （endoplasmic re⁃ticulum， ER） 通常被认为是负责调节蛋白质、 脂质和类固醇合成以及钙依赖性信号转导的细胞器。 在正常情况下， 正确折叠的蛋白质会通过分泌途径被转运至其指定的细胞位置。 但是在各种病理因素下，可引起蛋白质的错误折叠， 从而导致内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS）。 当ER 腔中的错误折叠的蛋白质超过ER 自身降解或处理能力时， 过度积累的畸形蛋白就会引起未折叠蛋白反应（unfolded protein response， UPR）［1-2］。 在适度的ER 压力下， UPR 可以作为促生存机制发挥作用， 使细胞恢复到稳态。 然而， 当细胞损伤超过了这种适应性反应的能力时， UPR 的持续激活会使细胞启动凋亡程序， 导致细胞的凋亡［3］。 肿瘤通过重新编程营养物质获取和代谢的途径， 以满足恶性细胞生物能量、 生物合成和氧化还原的需求。 这些重新编程的活动现在被认为是肿瘤的标志。 与正常细胞代谢不同， 肿瘤细胞即使在有氧的情况下， 仍通过糖酵解途径产生大量乳酸， 这种现象被称为Warburg 效应［4］。 这种糖酵解通量的增加是肿瘤细胞的代谢策略， 以确保肿瘤细胞在低氧浓度的环境中的存活和生长。 然而， 现在越来越多的研究表明， ERS 与肿瘤代谢的调控密切相关。 本文旨在对ERS 在肿瘤中的作用及揭示其与肿瘤代谢之间的关系作一综述。

1 ERS 与UPR

UPR 有3 种信号转导途径， 这些途径由3 种各自的ER 跨膜蛋白调控： 肌醇需求酶1 （inositol-requiring enzyme 1， IRE1）、 转 录 活 化 因 子6（activating transcription factor 6， ATF6） 以及蛋白激酶样内质网激酶（protein kinase-like ER kinase ，PERK）［5］。 在正常细胞条件下， PERK、 IRE1 和ATF6 与ER 中免疫球蛋白结合蛋白 （binding immunoglobulin protein， Bip） 形成稳定的复合物，使活性处于抑制状态［6］。 Bip 结合到ER 腔中的结构域上， 阻止了PERK 和IRE1α 的二聚化和磷酸化。 BiP 与ATF6 的结合会阻断其转运至高尔基体， 从而使ATF6 保留在ER 膜上， 阻止ATF6 的进一步加工［7］。 在细胞应激的状态下， ER 中不断积累错误折叠的蛋白质竞争性结合Bip， 导致Bip与PERK、 IRE1α 和ATF6 分离， 从而消除了其抑制作用， UPR 途径便会被激活来缓解ER 腔中错误折叠蛋白的负荷。 这个多途径的过程包括了减少核糖体活性的机制和增加ER 蛋白折叠能力的机制。 同时， ER 识别出末端错误折叠的蛋白质， 并通过ER 相关降解（endoplasmic reticulum-associated degradation， ERAD） 系统降解。 如果这些保护过程失败并且不能消除ER 压力， 则会激活细胞的死亡途径［3，8］。

2 UPR 信号通路

2.1 Bip 是UPR 信号通路的主要调节器 Bip 也称为葡萄糖调节蛋白 78 （glucose - regulated proteins， GRP78）， 在ERS 的适应性反应中起主要作用， 并且常在乳腺癌、 肺癌［9］、 前列腺癌和其他恶性肿瘤中都呈现高表达状态。 PERK、 ATF6和IRE1α 构成跨膜受体， 与结合的Bip 形成无活性、 稳定的复合物［10-11］。

PERK、 IRE1α、 ATF6 在UPR 信号通路3 个中央分支的激活中起关键作用。 并且， PERK 被认为是UPR 信号通路的主要调节因子， 它决定了细胞的命运， 控制细胞是否会发生凋亡。 Bip 常作为折叠酶， 防止错误折叠的蛋白质进一步运输或积累， 从而抑制UPR 信号转导通路的激活［12］， 当错误折叠的蛋白质与Bip 结合时， PERK、 IRE1α、ATF6 便从复合物中解离出来， 导致3 个传感器的磷酸化并激活其各自的UPR 信号通路。 每个分支都具有其独特的下游靶标， 它们会判定ER 中的压力情况， 根据ER 是否能代偿压力来切换决定性的分子机制。 Bip 既可以作为UPR 的正调节剂， 也可以作为负调节剂， 这表明Bip 在细胞对ERS 的适应性发展中起着重要作用。 在ERS 时Bip 仅在达到合成极限之前才进行适应。 在严重或长时间的ERS 条件下， Bip 无法抑制UPR 活化， BAX、BAK、 BH3 凋亡信号会依次被不可逆地激活［13］。

2.2 PERK 介导的UPR 信号通路激活的分子机制

PERK 是一种定位在ER 的跨膜蛋白， 属于Ⅰ型跨膜激酶， 由ER 腔中的N 端应力感应结构域和胞质C 端的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域构成。 当触发ERS 后， BiP 与PERK 发生解离， 导致其二聚化、 自身磷酸化和活化。 随后， eIF2α 发生PERK 依赖性磷酸化， 使ER 腔中mRNA 翻译被短暂阻断， 从而减少了ER 对蛋白质折叠。 同时， 磷酸化的eIF2α 还通过加速细胞周期蛋白D1 的消耗而引起细胞周期的停滞， 并选择性增强特定mRNA的翻译， 包括ATF6、 转录激活因子4 （ATF4）、X-box 结 合 蛋 白1 （XBP1）、 C／EBP 同 源 蛋 白（CHOP） 以及细胞凋亡抑制蛋白1 和2 （cIAP1／2）［14-16］。 ATF4 在促生存基因的转录调控中起关键作用， 主要与氧化应激、 自噬、 蛋白质折叠、 氨基酸合成和细胞分化有关［17］。 因此， ATF4 构成了氧化和代谢稳态的关键介质， 主要促进细胞存活［18-19］。 p-eIF2α 上调的其他蛋白质， 例如血管内皮生长因子A （VEGF-A） 或生长停滞和DNA损伤诱导蛋白GADD34 （在负反馈回路中使p-eIF2α去磷酸化） 被认为是克服细胞应激的关键［20］。 后者作为ATF4 靶标之一被ATF4 和PERK下游的CHOP 直接激活， 导致生长停滞和整体蛋白质合成恢复［21］。 相关研究发现， PERK 依赖性UPR 信号的激活， GRP78、 p-PERK、 p-eIF2α 和CHOP 表达的升高可能证实了这一途径［22］。 因此，选择性地诱导许多编码ER 伴侣蛋白和酶的基因的转录， 对修复压力造成的损伤和处理过量的未折叠蛋白至关重要。 否则， 总转录速率的降低会使得细胞发生凋亡［20］。

2.3 IRE1α 受体在决定细胞命运中的双重功能IRE1 有IRE1α 和IRE1β 有两种常见的同工型，IRE1α 在各类组织中普遍表达， 而IRE1β 在组织中表达受限［23-24］。 IRE1α 是Ⅰ型跨膜丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶， 具有位点特异性核糖核酸内切酶活性。 在ER 稳态时， IRE1α 与BiP 的物理相互作用会抑制其自身活性。 在ERS 时， IRE1α 单体发生聚合， 触发自身磷酸化使构象变化， 最终激活RNase 结构域［25］。 其随后与TNF 受体相关因子2（TRAF2） 的相互作用导致激活主要的促凋亡介质如JNK 和Caspase-12 蛋白［11，26］。 RNase 结构域可以启动2 个不同的下游UPR 信号转导途径： 分别通过XBP1 mRNA 的非常规剪接或通过IRE1α 依赖性 衰 变 （regulated IRE1α - dependent decay，RIDD） 途径促进的多种底物的转录后修饰［25，27］。由IRE1α 剪接的XBP1 进入细胞核以诱导UPR 靶基因的转录， 进而引发适应性反应， 包括ER 伴侣蛋白的上调和ERAD 泛素化机制的启动。 此外，活化的XBP1s 与缺氧诱导因子1α （HIF1α） 二聚化， 从而增强缺氧应答基因的表达， 如血管生成的关键因子VEGF-A［28］。 此外， XBP1s 可能会增强过氧化氢酶的表达， 其丢失可使细胞对应激诱导的细胞凋亡敏感。 这可能与细胞中过氧化氢酶缺乏、 ROS 的产生和p38 活化相关［29］。 然而， 不可逆的ER 压力条件下， XBP1 mRNA 的剪接停止，IRE1α 将激活RIDD 途径进行选择性切割来降解与ER 相关的蛋白的mRNA［30］， 这对促进细胞存活至关重要。 但是， 一旦ERS 加剧， RIDD 可能通过增强编码mRNA 的生存蛋白的降解来促进细胞死亡。然后凋亡启动蛋白caspase-2 会被激活， 直接导致线粒体依赖性细胞凋亡［31］。 有研究表明， ATF6 和PERK-ATF4 信号轴通过2 种独立机制激活IRE1α-XBP1 途径来促进XBP1s mRNA 的生成。 这种相互作用可以使细胞通过IRE1α-XBP1 途径来调控和适应各种类型和水平的应激［32］。 相反， IRE1α缺乏会通过PERK 依赖性自噬引起eIF2α 表达的降低， 从而导致细胞死亡增加［33］。

2.4 ATF6 在恢复ER 稳态中的重要作用 ATF6是碱性亮氨酸拉链转录因子， 有2 种同工型即ATF6α 和ATF6β［32］。 当ERS 时， ATF6 从ER 中被释放出来， 运送至高尔基体中。 在高尔基体内，ATF6 被蛋白水解酶S1P 和S2P 依次水解， 产生暴露氨基端部分的具有活性的转录因子ATF6（p50）［16］。 然 后， 经 切 割 的 ATF6 转 录 因 子（ATF6 p50） 进入细胞核， 以调节UPR 靶基因的转录， 进而使ER 中的压力得以缓解［23］。 据报道，UPR 信号通路的ATF6 和IRE1α 介导的分支是互连的， 它们都参与上调Bip、 XBP1 与ERAD 相关的蛋白质。

3 ERS 介导调控肿瘤能量代谢的分子机制

长期以来， 癌症已经改变了新陈代谢的方式，以满足其无限制增殖潜能的需求。 肿瘤微环境中低氧、 细胞外低pH 和低葡萄糖浓度的特征， 在肿瘤的代谢中起到了决定性的作用［6］。 葡萄糖代谢的改变是肿瘤细胞特征之一。 葡萄糖是主要的能源， 在生理条件下， 在线粒体中被氧化， 通过氧化磷酸化生成ATP。 在低氧条件下， OXPHOS 降低， 并且糖酵解途径被激活。 由于糖酵解产生ATP 的效率低下， 所以肿瘤细胞对葡萄糖的吸收需求更高。 肿瘤细胞以这种方式改变其代谢是因为能节省氧气， 支持脂质和核苷酸合成以及持续增殖所必需的氧化还原平衡， 同时还能维持足够的能量产生。 因此， 肿瘤细胞选择了能量效率低的途径以维持提供代谢中间体和氧化还原当量用于大规模生物合成［34］。

最近， 许多研究表明， 在ERS 发生时， 其在肿瘤代谢的调控中起到了重要的作用， 相关分子机制也已被揭示。 下面将具体阐述其在肿瘤中的几个靶点。

3.1 AMPK 参与ERS 对肿瘤代谢的调控 在真核细胞中， 腺磷酸激活的蛋白激酶（AMPK） 在调节细胞能量平衡中起主要作用。 AMPK 可以直接通过结合腺嘌呤核苷酸感受能量的变化， 被相对于ATP 的AMP／ADP 增加激活。 AMPK 的激活增加了分解代谢（ATP 生成） 途径的速率， 并降低了合成代谢（ATP 利用） 途径的速率。 除了维持细胞内能量平衡外， AMPK 还调节全身能量代谢。Han 等［35］研究发现一种从药用植物中分离出来的酚类黄酮Hispidulin， 剂量依赖性地抑制人肝癌细胞生长并通过线粒体凋亡途径促进细胞凋亡。 进一步研究发现， 经Hispidulin 处理后的肝癌细胞中的ERS 标志物 （磷酸化的PERK 和eIF2α 以及ATF4、 CHOP） 和裂解的caspase-12 的表达以剂量依赖性方式显著增加。 而在使用选择性ERS 抑制剂或靶向UPR 蛋白CHOP 的shRNA 预处理后可以有效地扭转由Hispidulin 诱导的细胞凋亡。 进一步研究发现Hispidulin 有效地增加了AMPK 的磷酸化， 抑制mTOR， 从而阻断了癌细胞的合成代谢与能量的利用， 促进了凋亡基因的表达。 用AMPK siRNA 或抑制剂处理细胞可显著消除Hispidulin 对CHOP 表达和凋亡相关蛋白表达的影响， 逆转了其对细胞的促凋亡作用。 这表明AMPK 参与了ERS介导的Hispidulin 对肝癌细胞的促凋亡作用。Leclerc等［36］研究发现， 二甲双胍能够有效诱导急性淋巴细胞白血病（ALL） 细胞凋亡， 具体机制为二甲双胍可激活AMPK， 上调ERS 标志物IRE1α 和CHOP 导致UPR 介导的细胞死亡。 使用AMPK shRNA， 证明二甲双胍诱导的细胞凋亡是AMPK 依赖性的， 因为AMPK 敲除可拯救ALL 细胞， 这与IRE1α 和CHOP 的下调以及UPR 功能的恢复相关。 此外， 雷帕霉素可将细胞从二甲双胍诱导的细胞凋亡和CHOP 表达下调中拯救出来。证明二甲双胍诱导的淋巴母细胞凋亡是通过完全依赖AMPK 的UPR 介导发生的。 有研究发现， 核糖体S6 激酶2 （RSK2） 在ERS 诱导的乳腺癌细胞自噬中起关键作用。 其机制为ER 应激诱导RSK2的激活使Thr172 处的AMPKα2 磷酸化， 导致了细胞能量利用不足， 从而触发了mTOR 发出的细胞自噬信号［37］。

3.2 AKT 参与ERS 对肿瘤代谢的调控 AKT 是一种丝氨酸／苏氨酸激酶， 是PI3K 信号通路转导中的关键因子， 是细胞生长和分化的信号分子。更重要的是， p-AKT 是不同细胞中葡萄糖代谢的关键调节分子， 在人类神经胶质瘤中， p-AKT 对糖酵解的作用主要是通过调节HK2 向胶质瘤细胞中的线粒体迁移， 从而导致OXPHOX 的抑制作用和大量乳酸的产生。 Hou 等［38］研究发现， PERK在人类神经胶质瘤组织中被显著激活， 而且在PERK 沉默的神经胶质瘤中， 其细胞肿瘤形成能力降低。 进一步研究其机制发现， 在低葡萄糖代谢应激下， PERK 基因的沉默明显抑制了细胞的活力、 ATP 和乳酸的产生， 这是由于AKT 和PERK都是重要的癌症调节因子， AKT 的磷酸化可以通过PERK 激活来调节［39］。 而PERK 基因的沉默则会阻断AKT 的磷酸化并随后抑制神经胶质瘤细胞HK2 的线粒体易位， 从而减弱了糖酵解过程和细胞活力。 所以PERK 对肿瘤代谢的调控是通过调节AKT 来实现的。 此外， DeSalvo 等［40］研究发现2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose， 2-DG）在常氧下诱导ALL 细胞的生长抑制和细胞死亡。进一步研究发现， 经2-DG 处理的ALL 细胞表现出p-Akt 的上调以及ER 应激标记物 （IRE1α、GRP78、 p-eIF2α 和CHOP） 的表达增加。 当使用AKT 抑制剂后， UPR 被抑制， 并使ALL 细胞对2-DG 诱导的细胞死亡更加敏感。

3.3 HIF-1α 参与ERS 对肿瘤代谢的调控

HIF1α 是细胞对低氧反应的关键调节因子， 能激活包括血管生成、 细胞存活、 糖代谢和侵袭等在内的与癌症生物学关键方面有关基因的转录。 肿瘤内缺氧和基因改变可导致HIF-1α 过度表达， 这与几种癌症类型的患者死亡率增加相关。 在临床前研究中， 抑制HIF-1α 活性对肿瘤生长有显著影响。 Chen 等［28］研究发现XBP1 在三阴性乳腺癌中被激活， 并在该人类乳腺癌亚型的致瘤性和进展中起关键作用。 通过实验表明在乳腺癌细胞系模型中， 降低XBP1 的表达后抑制了肿瘤的生长和肿瘤的复发。 进一步研究， 在XBP1 转录调控网络的全基因组定位下发现， XBP1 通过与HIF1α 组装转录复合物来驱动三阴性乳腺癌致瘤性， 该复合物通过募集RNA 聚合酶Ⅱ来增强其下游靶标糖酵解相关蛋白己糖激酶Ⅱ（hexokinase Ⅱ， HKII）、 葡萄糖转运体1 （glucose transporter 1， GLUT1） 和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDHA） 的表达， 促进了细胞糖酵解的过程， 增强了乳腺癌细胞在缺氧条件下的耐受性， 使其更好地在低氧条件下存活。 相反， Ivanova 等［41］研究发现， 在缺氧条件下， UPR 的PERK 通路的激活可以通过阻止有效的HIF-1α 翻译来抑制HIF-1α 的水平和活性。 进一步研究发现， PERK 的激活后， 通过阻止RNA 结合蛋白1 （YB-1） 与HIF-1α mRNA 5′UTR 相互作用来抑制从头合成HIF-1α 蛋白， 减弱了HIF-1α 对下游糖酵解靶标基因的表达， 使癌细胞对缺氧敏感。 而PERK 的化学抑制作用可挽救HIF-1α 缺陷和HIF-1α 活性水平。 证明UPR的PERK 通路的激活可以使肿瘤细胞对低氧应激敏感， 导致其在低氧条件下细胞活力的降低。

3.4 Wnt／β-catenin 信号通路参与ERS 对肿瘤代谢的调控 细胞发育和生长控制中的许多信号通路都参与了缺氧反应， 这包括在胚胎发育、 组织稳态和肿瘤发生中起重要作用的进化保守的Wnt／β-catenin 信号通路。 研究发现， 低氧条件下ERS降低了β-catenin 的稳定性， 从而增强了HIF1α 介导的低氧反应中UPR 的转录因子XBP1s 的活性，促使肿瘤在低氧条件下生存并生长。 且研究其具体机制发现， 在具有Wnt 刺激的β-catenin 信号级联反应的人结肠癌细胞系中， 缺氧时ER 压力增加伴随着低密度脂蛋白受体相关蛋白6 的减少， 并且这种减少会导致β-catenin 的积累减少， 使得Wnt／β-catenin 信号转导受损。 值得注意的是，β-catenin与XBP1 和HIF-1α 相互作用， 抑制了XBP1 介导的HIF-1α 靶基因表达的增加。 此外，在缺氧条件下， Wnt 刺激或β-catenin 的过度表达减弱了XBP1s 介导的细胞存活［42］。 综上所述， 这些结果揭示了Wnt／β-catenin 途径减弱了缺氧性UPR 对肿瘤细胞的保护作用， 抑制了细胞的糖酵解过程， 促进了肿瘤细胞在缺氧条件下的凋亡。

4 小结与展望

UPR 是一种信号转导途径， 当细胞无法在ER内维持蛋白稳定时被激活。 为了处理ER 腔中错误折叠的蛋白质的积累导致的应激， UPR 启动适应性反应， 来减少蛋白质折叠负荷并增加ER 分泌途径恢复稳态的能力。 但是， 如果这些纠正措施未能成功恢复ER 内的蛋白稳态， 则UPR 会触发死亡信号以引起细胞死亡。 与正常细胞不同， 肿瘤细胞的生存面临着许多对ER 蛋白质稳态的威胁，包括缺氧、 营养缺乏、 蛋白酶体功能障碍以及对分泌途径的需求增加。 肿瘤细胞有氧糖酵解的这种特殊代谢方式巧妙地与UPR 联系了起来。 根据肿瘤模型的不同， UPR 激活可调节细胞存活、 能量代谢、 血管生成、 侵袭和转移。 因此， UPR 正在成为肿瘤代谢中有吸引力的治疗靶标， 但是还需要进行更多的研究来了解在任何特定肿瘤类型中调节UPR 的益处和风险。