采用毛细管凝胶电泳技术检测常见乳源成分

刘鸣畅,王洪越,方舒正,李唯熙,杨艳歌,吴亚君

（1.中国检验检疫科学研究院，北京100176；2.河北工程大学，河北邯郸056038）

0 引言

2018年《国务院办公厅关于推进奶业振兴保障乳品质量安全的意见》[1]中提出，积极发展乳肉兼用牛、奶水牛、奶山羊等其他奶畜生产，进一步丰富乳源结构。并且，农业农村部等九部委联合印发《关于进一步促进奶业振兴的若干意见》[2]明确指出要重视开发羊乳、水牛乳等特色乳制品。驴乳、马乳、骆驼乳、水牛乳、牦牛乳、羊乳等作为市场上的主要特色乳品，近年来得到了良好的发展，产量均呈上升趋势[3-5]。

相关研究表明，特色乳因其蛋白结构与牛乳蛋白存在差异，所以致敏性较低[6-7]，特别是对于体弱的婴幼儿和老年人。Caballos等[8]研究表明与牛乳蛋白相比，山羊奶蛋白更易消化且致敏性较低；Egito等[9]研究认为马乳可以大大缓解消化系统和心血管系统疾病症状；骆驼乳对于Ⅰ型糖尿病患者的微量白蛋白尿症状有明显的辅助治疗作用；此外，驴乳乳清蛋白含量较高，更接近于母乳乳清蛋白含量，是作为一段婴幼儿配方乳粉的优质原料[10-12]。但由于驴、马、羊、骆驼等动物产奶率较低，所以特色乳品的售价较高，在经济利益驱动下，以牛乳掺假的现象较为常见。为保护消费者权益，确保乳源真实性，建立一个特色乳品乳源检测的评价体系是十分必要的。

现有报道的特色乳品乳源检测的方法主要有核酸检测[13-14]、色谱质谱分析[15-17]、蛋白质检测[18]、免疫检测[19-21]等。不同的方法因其特点不同，应用场合也有所差别。如核酸与免疫检测，适用于一线及现场检测，可实现大量样本的初筛；质谱和传统蛋白质检测技术在实验室研究方面应用更为广泛。Ren等[22]研制ELISA检测试剂盒，可实现对牦牛乳中牛乳成分的现场检测；Calleja等[23]研制的实时荧光检测试剂盒可对羊乳中牛乳成分进行快速检测；Blasi等[24]通过对三酰基甘油的立体专一分析实现对驴奶、牛奶、绵羊奶、山羊奶和水牛奶的判定。Francisco等[25]通过元素含量测定结合函数计算，可对牛乳、山羊乳、绵羊乳进行很好的区分。

乳及乳制品中富含蛋白质，蛋白质分析也是对乳品真伪、品质以及性状研究的重要手段。有研究表明，各种乳品的蛋白质在种类和含量上均存在一定差异[26]。毛细管凝胶电泳技术，在电压的驱动下将蛋白根据分子量进行分离。笔者所在实验室前期也采用毛细管电泳技术对乳品中的大豆蛋白成分[27]、羊乳婴幼儿配方乳粉中的牛乳成分[28]均建立了检测方法。说明毛细管凝胶电泳技术可以作为乳品真实性判别的重要手段。本研究采用毛细管凝胶电泳技术，通过筛选出驴乳、马乳、骆驼乳、水牛乳、牦牛乳、牛乳、羊乳等多种乳的多个靶标蛋白峰，以及判定标准，形成系列评价体系，实现对常见乳源成分进行检测。并考察该方法在稳定性、重复性以及灵敏度等方面的参数，并对市售样品的检测情况，初步验证了毛细管凝胶电泳技术作为多种特色乳品乳源检测方法具有很好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

标准样品：水牛乳收集自广西水牛研究所，马乳和羊乳为实验室派员前往内蒙古收集，骆驼乳委托内蒙古海关技术中心收集，牦牛乳、牛乳委托中国农业大学收集，驴乳委托山东海关技术中心收集；标准样品均经过实时荧光PCR检测，确定其为标准样品。市售乳制品购自北京某超市。

1.1.2 主要试剂

毛细管电泳仪SDS-MW试剂盒，美国Sciex；BCA蛋白定量试剂盒，德国Merck；β-巯基乙醇，美国Sigma-Aldrich。

1.1.3 主要设备

PA800 plus毛细管电泳仪，美国Sciex；及光电二极管阵列检测器，PDA检测器，美国Sciex；5418R冷冻离心机，德国Eppendorf；微量移液器，德国Eppendorf；超声波清洗仪，国产；涡旋振荡器，Genie公司；电子天平，Sar torius公司；水浴锅。

1.2 蛋白浓度测定

使用BCA蛋白定量试剂盒测定对各乳品标准样品及市售样品进行蛋白含量测定。所有样品重复3次。在酶标仪上560 nm读数，制作标准曲线，并计算各样品蛋白质量浓度。

1.3 毛细管凝胶电泳方法

将样品按照测定浓度将样品稀释至15 mg/mL，量取500μL液态乳样品置于15 mL离心管中，加2%SDS样品缓冲液7 mL，涡旋震荡，至充分溶解。移液枪吸取稀释后的样品10μL于1.5 mL离心管中，加入1μL 10 ku内标蛋白溶液、85μL SDS样品缓冲液，并在通风柜中加入5μLβ-巯基乙醇，盖紧瓶盖、充分混合，于沸水浴中加热3 min，取出后用常温水冲洗冷却30 s，上样电泳分析。毛细管柱为50μm×30.2 cm非涂层石英毛细管。电泳步骤几及条件如表1所示，采用检测器为光电二极管阵列(PDA)检测器，在4℃条件下检测，获取数据。

表1 毛细管电泳步骤及条件

2 实验结果

2.1 蛋白浓度测测定

测定牛乳、水牛乳、牦牛乳、驴乳、马乳、羊乳、骆驼乳样品的总蛋白浓度，每个样品三次重复测定取平均值，发现骆驼乳、牦牛乳蛋白浓度较高，马乳、驴乳蛋白浓度较低。为了保证不同乳品总蛋白浓度不对实验结果造成影响，我们用蒸馏水对蛋白浓度大的乳样品进行适量稀释，使其蛋白浓度约为15 mg/mL，并进行总蛋白浓度测试，结果如表2所示。

表2 7种乳品蛋白浓度测定结果

2.2 不同乳品差异分析

2.2.1 不同乳品蛋白特征峰筛选

我们收集了真实属性的牛乳、水牛乳、牦牛乳、驴乳、马乳、羊乳、骆驼乳，采用优化后的毛细管凝胶电泳方法对样品的蛋白质组分进行分析，每个样品进行三次独立重复实验，以确保图谱峰形稳定可靠。结果如图1所示。在马乳和驴乳中，稳定存在特征蛋白峰W3，而在其他乳品中均为出现，所以，W3可作为马属动物乳源特征蛋白峰。通过对牦牛乳、水牛乳、奶牛乳等牛属动物电泳分析发现，3种乳中蛋白峰C4的相对迁移时间与其他乳不同，可作为牛属动物的特征蛋白峰。W2蛋白峰在骆驼乳中含量极低，根据前期研究，W2蛋白位于乳清蛋白区域，结合文献研究[29-30]，骆驼乳中缺乏β-乳球蛋白，所以可以初步判定W2即为β-乳球蛋白，该蛋白可作为骆驼乳掺假的参考指标。本课题组前期研究证明，C1蛋白，即为β-酪蛋白，是牛乳特征蛋白，与羊乳C1相对蛋白迁移时间不同，本实验结果显示，牛乳中该蛋白的相对迁移时间也与驴乳和马乳中的不同。

同时，我们发现，分子量为14 ku左右的蛋白W1在两种乳中均存在，根据分子量判别其为α-乳球蛋白（α-Lactalbumin,α-La）。骆驼乳中W1蛋白与W2蛋白的峰面积比值较大，牛乳中该峰面积比值较小。

图1 牛乳、水牛乳、牦牛乳、驴乳、马乳、羊乳、骆驼乳毛细管凝胶电泳图谱

2.2.2 不同乳品差异因子分析

应用SIMCA软件，针对不同乳品主要蛋白的与10 ku内标的相对迁移时间，以及蛋白峰W1与W2的比值进行聚类分析，结果如表3所示，采用主成分分析（PCA）对数据进行处理，构建模型，结果如图2所示。我们发现，马乳和驴乳主要性质相近，与其他乳差异较大，骆驼乳与其他乳差异也较大。通过差异因子分析，我们确定W1、W2峰面积比为骆驼乳特征因子；W3蛋白峰为马乳和驴乳特征因子；C4蛋白相对迁移时间为牛属乳品特征因子。

图2 不同乳品差异因子PCA聚类分析模型

2.3 方法重复性及稳定性

为考察毛细管凝胶电泳法的方法重复性与稳定性，将牛乳标准样品按照标准操作程序进行毛细管电泳，进行6次独立重复试验，以及单次试验连续进样6次，重复性实验结果图谱如图3所示。对样品图谱进行积分，计算出峰时间。重复性试验中，牛乳中15个蛋白峰与10 ku内标蛋白出峰时间差值的相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD）均不高于0.06。稳定性试验中，牛乳中15个蛋白峰与10 ku内标蛋白出峰时间差值的RSD均不高于0.03。

图3 牛乳蛋白毛细管电泳图谱稳定性试验结果

2.4 特色乳品检测灵敏度

为考察所选定的三个特征蛋白峰的检测灵敏度，由于牛乳成本最低，产量最大，为最主要掺假基质，所以分别将相同浓度的驴乳与牛乳、骆驼乳与牛乳进行梯度配比，使牛乳的质量分数分别为0%、5%、10%、50%、100%，进行毛细管凝胶电泳分析，并进行3次重复试验。

2.4.1 驴乳中牛乳成分检测灵敏度

不同配比梯度驴乳与牛乳掺比样品结果如图4所示，驴乳特征蛋白W3在样品中稳定存在，且不与牛乳蛋白发生重叠。但是牛乳特征蛋白C4的灵敏度较低，仅能检测到在含牛乳比例不低于10%的样品。但是，我们发现C1蛋白，在含5%牛乳的驴乳样品中蛋白峰明显，可作为判别驴乳和马乳中含有牛乳的判别依据。

图4 不同配比梯度的驴乳样品毛细管凝胶电泳图谱

表3 不同乳品蛋白峰与蛋白内标相对迁移时间以及W1、W2蛋白峰峰面积比值结果

2.4.2骆驼乳中牛乳成分检测灵敏度

不同配比梯度骆驼乳与牛乳掺比样品结果如图5所示，牛乳特征蛋白C4在样品中稳定存在，且不与骆驼乳蛋白发生重叠。但是骆驼乳中的牛乳特征蛋白C4灵敏度也较低，同样是仅能检测到在含牛乳比例不低于10%的样品。同时，根据前期实验结果，应用软件积分，计算W1和W1蛋白峰的峰面积，计算W1蛋白峰与W1蛋白峰的峰面积比值，结果如表4所示。牛乳W1与W1的峰面积比值为0.322，骆驼乳W1与W1的峰面积比值为3.907，线性相关系数为0.9975。

图5 不同配比梯度的骆驼乳样品毛细管凝胶电泳图谱

表4 样品中W1蛋白峰与W1蛋白峰的峰面积比值

2.5 市售样品检测

图6 市售乳品毛细管凝胶电泳图谱

我们从市场上购买了7个特色乳产品，按照建立的方法进行毛细管电泳检测，结果如图6所示。可见，山羊乳粉和羊乳粉样品中未检测到与牛乳C1蛋白相对迁移时间相同的蛋白，判定其为羊乳产品；马乳乳饮料样品中，蛋白峰峰形不明显，推测其经过了强热加工处理，蛋白水解严重，但是未见与牛乳C1蛋白相对迁移时间相同的蛋白，W3蛋白位置有蛋白峰，所以，初步判定其为马乳制品；骆驼配方乳粉中，可见与牛乳C1蛋白相对迁移时间相同的蛋白，经积分计算，W1与W2的峰面积比值为1.278，判别其中含有牛乳成分，冻干驴乳粉中，W3蛋白峰明显，并且未出现与牛乳C1蛋白相对迁移时间相同的蛋白，判定其为驴乳制品；牦牛乳和水牛乳样品中，C1蛋白和C4蛋白相对迁移时间与牛科动物乳品特征一致，证明其为牛科动物乳制品。

3 讨论

现在对于特色乳品的物种判别检测方法的研究已经成为乳品真伪及品质研究的热点，现在主要报道的检测技术研究中，如Sachinandan等[31]采用单重和多重PCR法可对液态乳及乳酪中的水牛源与牛源成分进行检测，检测灵敏度可达0.1%，但是对于复杂基质样品或者混用生产线的乳制品容易造成假阳性。Hurley等[20]开发了一种基于间接竞争性ELISA法的牛乳成分快速检测方法，可用于快速检测羊奶、绵羊奶和水牛奶中的牛奶，检测灵敏度可达0.1%。但是免疫技术过于依赖抗体质量，现今，特色乳品种类越来越多，对于近源物种的乳品蛋白是否存在交叉反应仍需进一步确认，而且对于特色乳品中的少量污染成分，以及复杂基质的乳品容易产生假阳性。张鑫等[32]开展研究，将93份牛乳、马乳、山羊乳、骆驼乳及不同比例掺比样品进行脂肪酸指纹分析，结合化学计量学分析构建判别模型，模型判别准确性可以达到90%。但是模型判别对于建模样品要求很高，不便于检测方法推广。Katharina等[33]采用双向电泳结合高分辨质谱技术，发现骆驼乳缺乏β-乳球蛋白，并且可通过蛋白质指纹图谱比对，实现对牛、山羊、水牛、马和骆驼乳的区分。但是双向电泳法操作繁杂，需要操作者有一定的实验经验，并且耗时较长，检测通量低，不适于大量检测样品的开展。Ke X等[34]建立UHPLC-MS/MS法，可对羊乳婴幼儿配方乳粉中的4种牛乳酪蛋白和2种牛乳乳清蛋白进行检测，检测定量限可达0.01～0.05 g/100 g，可对复杂基质进行检测。但是，超高效液相色谱-质谱联用设备，设备成本高、对环境要求高，对实验人员素质要求也较高，不易实现大规模推广。毛细管电泳技术检测结果稳定，重现性好、重复性高，检测快捷高效，可以实现对靶标蛋白的快速筛查。

本研究采用毛细管电泳技术，通过对各乳品蛋白与10 ku内标蛋白相对迁移时间，以及W1和W2蛋白峰峰面积比值进行聚类分析，筛选出差异较大的多个靶标蛋白峰，以及判定标准，实现对常见乳源成分进行检测。初步建立了可实现马科的驴乳和马乳、骆驼乳、羊乳、和牛族动物（牛、水牛、牦牛）乳的区别。经过电泳分析，我们可以发现，驴乳和马乳出峰时间、峰面积比值基本相同，所以我们选取驴乳为研究对象，分析马乳和驴乳与牛乳蛋白差异，蛋白W3稳定存在马乳和驴乳中，可作为马乳和驴乳靶标蛋白；此外，结合本次试验以及前期研究，牛族动物（牛、水牛、牦牛）乳特征蛋白C1和C4相对迁移时间可作为判定牛乳蛋白的靶标蛋白。本研究未找到骆驼乳特征蛋白，但是骆驼乳中β-乳球蛋白含量较低，其常见掺假乳品—牛乳的β-乳球蛋白含量较高，并且掺假现象主要是经济利益驱动，掺假比例过低无法获得经济效益，所以，选定10%为检测限，W1与W2的峰面积比值不低于3.5，并且存在C4蛋白则说明骆驼乳中掺杂牛乳。

但是，随着人民生活水平的提高与乳品营养学研究的深入，牦牛乳、水牛乳等乳品也以其致敏性较低、营养丰富[35-36]等特点，越来越受到人们青睐，但是本研究建立的方法还无法对牛、水牛、牦牛乳进行很好的区分，后面的研究中，我们将通过尝试毛细管区带电泳、毛细管胶束电泳等电泳模式，对其进行区分研究。同时，现在所构建的聚类模型由于数据量有限，无法进行样品识别，后期我们将扩充样本量，研究构建判别模型。

4 结论

本研究采用毛细管凝胶电泳技术，计算各乳品蛋白峰与内标蛋白相对迁移时间，构建聚类分析模型，筛选特色乳品及牛乳的多个靶标蛋白峰以及判定标准，实现对常见乳源成分进行的检测，方法精密度和重现性良好。在对市售特色乳品样品检测过程中，发现高比例的掺假产品。