DNA甲基化修饰在甲状腺癌中的研究进展

林松荣，张 磊，罗金现，秦克旺

(1.南方医科大学第二临床医学院，广东 广州 510317；2.广东省第二人民医院，广东 广州 510317)

甲状腺癌是世界范围内最常见的内分泌系统恶性肿瘤，尽管相对少见，但是一些流行病学研究[1]表明，其发病率在过去几十年中仍逐渐增加，其原因可能与颈部超声等成像技术的改进和广泛应用有关。目前发现DNA甲基化是调节甲状腺癌进展的重要因素。DNA甲基转移酶(DNMT)催化的DNA甲基化是重要的表观遗传修饰之一，在控制基因表达和维持基因组结构上扮演着关键角色。异常DNA甲基化通常发生在转录因子的启动子区域，主要通过高甲基化或低甲基化导致肿瘤的发生。DNA高甲基化表示甲基化的获得，常常发生在抑癌基因上，导致其转录的抑制和表达的下降；而DNA低甲基化则表示甲基化的缺乏，可激活原癌基因并影响染色体的稳定性。DNA甲基化是人类肿瘤早期分子变化的表征和反映，这预示着对其的开发研究有望提供一种早期识别和预防肿瘤的新方法。

1 甲状腺癌中抑癌基因甲基化

与其他肿瘤一样，异常甲基化导致肿瘤抑制基因的不适当沉默，在甲状腺癌中广泛存在。这些抑癌基因包括ARAS相关区域家族基因1A(RASSF1A)、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)、组织金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)、死亡相关蛋白激酶(DAPK)、维甲酸受体β2(RARβ2)、上皮钙黏附素(ECAD)、MutL同源基因1(MLH1)、p16及共济失调-毛细血管扩张突变基因(ATM)等。通常这些基因具有良好的抑癌作用，但是异常高甲基化使得上述基因的表达降低，继而促进了甲状腺癌的发生与发展。

1.1 RASSF1A RASSF1A是最常被描述的抑癌基因之一，在许多肿瘤中可以观察到它的失活。RASSF1A影响多种细胞过程，包括参与基因组稳定性维护、微管动力学、细胞周期调控、细胞凋亡和细胞运动等，启动子高甲基化使得上述功能丢失，从而促进肿瘤的发生。Brown等[2]的研究显示，在甲状腺滤泡性增生(FTH)中，RASSF1A启动子高甲基化及其导致的基因表达沉默经常发生，推测RASSF1A可能在甲状腺肿瘤形成的早期发生甲基化，并有助于FTH向甲状腺腺瘤(FA)和甲状腺癌演变。Kunstman等[3]报道，甲状腺乳头状癌(PTC)中RASSF1A平均高甲基化水平是正常甲状腺组织的4.2倍，且RASSF1A甲基化与PTC的多灶性明显相关，但与囊外侵袭呈负相关。Stephen等[4]研究发现，Classic型FTC和Hurthle型FTC间RASSF1A甲基化程度差异明显，Classic型FTC的RASSF1A甲基化水平较高，提示RASSF1A甲基化程度可作为区分这两种FTC亚型的分子标记。

1.2 PTEN PTEN的表达产物被认为是一种脂质和蛋白质双重磷酸酶，后者通过脂质磷酸酶活性负向调控PI3K/AKT信号通路而发挥抑癌作用。在甲状腺癌中，PTEN受抑制的频率高于突变或缺失的频率，很可能是基因启动子区的高甲基化引起其表达抑制[5]。Hou等[6]研究了良性甲状腺腺瘤、FTC和甲状腺未分化癌(ATC)中PI3K/AKT通路基因改变与PTEN甲基化的关系，发现PTEN甲基化程度随着肿瘤恶性程度的升高而增加，同时PTEN异常甲基化增强了PI3K/AKT通路的信号传递，后两者的相互作用可能促进了甲状腺肿瘤的发展。Alvarez-Nunez等[5]研究显示，FA和FTC中PTEN甲基化发生率分别为83%和85%，PTEN高甲基化可能在甲状腺肿瘤(尤其是滤泡性肿瘤)的发生中起作用。

1.3 TIMP3 TIMP3是基质金属蛋白酶(MMPs)的内源性抑制剂，与MMPs结合能有效抑制后者活性，通过诱导细胞凋亡、抑制肿瘤增殖、抑制血管生成和转移而发挥抑癌作用。TIMP3启动子是一个经常被靶向的甲基化位点，其高甲基化所致表达沉默在多种肿瘤中具有致癌性[7]。Hu等[8]研究显示，PTC中TIMP3甲基化与肿瘤的腺外侵犯、淋巴结转移和多灶性密切相关。

1.4 DAPK DAPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过调节不同的信号事件发挥作用，包括细胞凋亡、自噬和膜起泡，促进细胞凋亡为其基本功能。DAPK在包括甲状腺癌的多种癌症中处于失活状态，很大程度上归因于基因启动子区的高甲基化。在Hu等[8]的研究中，PTC中DAPK启动子甲基化率为34%(78/231)，且DAPK甲基化与肿瘤的多灶性和大小有关。

1.5 RARβ2维甲酸受体(RARs)是类固醇激素受体超家族成员，通过与维甲酸类物质相互作用而发挥调节细胞生成、分化、凋亡以及抑制多种组织癌变的作用。目前大多数研究聚集在RARβ2。RARβ2在多种肿瘤的发生发展过程中表达减少，部分研究认为是由于其基因启动子区CpG岛甲基化导致表观遗传沉默。黄铀新等[9]对循环肿瘤DNA的研究表明，RARβ2甲基化率在甲状腺癌组中明显高于甲状腺良性结节组，且与甲状腺癌临床分期相关，同时研究结果提示RARβ2异常甲基化与甲状腺癌的发生、发展有关。Kiseljak-Vassiliades等[10]研究证实，在PTC中TIMP3、SLC5A8及DAPK甲基化与吸烟仅有关联趋势，而RARβ2甲基化与吸烟有统计学相关，但是对于后两者的相互作用如何促进PTC发生仍有待研究。

1.6 ECAD ECAD是经典的肿瘤抑制因子，其编码产物是一种黏附蛋白，在维持细胞黏附和上皮细胞表型方面发挥重要作用。ECAD表达丢失主要发生在表观遗传学水平，并且与肿瘤的进展和转移有关[11]。Jensen等[12]报道，PTC中ECAD甲基化率为39.3%(26/66)，并与甲状腺外侵袭和转移有关，同时该研究提示表观遗传机制和肿瘤坏死因子(TNF)诱导的信号通路各自独立地调控ECAD的表达和定位，这些机制既促进了甲状腺癌细胞的侵袭性，也可能在原发肿瘤中诱导上皮向间质转化以及淋巴结转移瘤中促使间质向上皮转化方面发挥重要作用。

1.7 MLH1 MLH1是错配修复基因之一，其编码的蛋白质产物是DNA错配修复通路的组成部分，可在复制过程中有效地替换错配碱基，防止DNA损伤的累积。MLH1甲基化常常先于胃癌、肺癌和乳腺癌等的恶性增殖出现，因此其甲基化检测可用于肿瘤发生的预测[13]。陆晓筱等[14]研究发现，MLH1基因启动子甲基化与PTC的大小、多灶性、腺外侵犯、T分期和颈部淋巴结转移紧密相关，该基因的甲基化检测有望成为PTC早期筛查和手术评估的指标。Santos等[15]研究指出，在PTC、FTC和良性甲状腺病变中，MLH1甲基化率分别为44%、33%和64%，并且MLH1表达降低与BRAF V600E突变、RET/PTC重排和转换(IDH1和NRAS)有关。

1.8 p16 P16基因又称多肿瘤抑制基因(MTS1)，其编码产物是一种细胞周期的负调节因子，通过与CDK4或CDK6结合，抑制CDK4或CDK6与细胞周期蛋白D之间复合物的形成，阻断Rb蛋白磷酸化，诱导细胞G1期阻滞，进而调控细胞周期。p16在PTC中表达失调很少通过突变引起，已有的研究表明CpG岛甲基化是p16失活的重要因素。Wang等[16]研究显示，p16在PTC中的甲基化率为27%(20/74)，并与肿瘤TNM分期、高AMES(年龄、远处转移、腺外浸润、大小)及转移呈正相关，认为p16甲基化与PTC生物学转移特性和组织学特征相关。戴亚丽等[17]研究指出，PTC中p16的甲基化率为54%(27/50)，且该基因甲基化与PTC的发生和发展有关。

1.9 ATM ATM在维持基因组稳定性和提高细胞生存率方面具有重要作用，其编码的蛋白质能够激活不同的效应底物，参与细胞周期调控、DNA双链修复以及细胞凋亡等过程。Brait等[18]研究显示，ATM在正常甲状腺组织、良性甲状腺腺瘤和甲状腺癌中的甲基化频率分别为80%、53%和71%。

2 甲状腺癌中原癌基因与甲基化

2.1 BRAF与DNA甲基化 BRAF突变是PTC中最常见的遗传事件，其参与甲状腺癌发生的主要信号途径是RAS/BRAF/MEK/ERK通路。BRAF突变通常导致PTC具有侵袭性的临床病理特征和更差的预后。目前的一些研究认为甲状腺癌中BRAF突变与肿瘤抑制基因甲基化关系密切。Hu等[8]研究了PTC中抑癌基因甲基化与肿瘤临床病理特征及BRAF突变的关系，结果显示TIMP3、SLC5A8、RARβ2及DAPK的甲基化与PTC的一些侵袭性特征和BRAF突变有关，并推测上述抑癌基因的甲基化可能是BRAF突变促进PTC发生及侵袭性形成的重要环节。Botezatu等[19]研究发现，在BRAF突变阳性的甲状腺癌样本中抑癌基因TIMP3、RARB、MGMT及NEUROG1的甲基化值较高，表明BRAF突变与这些基因甲基化显著相关。

另外有研究分析了BRAF突变和甲状腺癌DNA整体低甲基化的关系(Alu重复序列整体低甲基化作为DNA整体低甲基化的替代标记)，发现在远处转移的分化型甲状腺癌(DTC)中，伴有BRAF突变的肿瘤Alu低甲基化增加，表明BRAF突变与DNA整体低甲基化相关，同时BRAF突变与远处转移性DTC相关，但与低风险DTC无关[20]。

2.2 其他原癌基因与DNA甲基化 肿瘤中原癌基因的甲基化形式通常为低甲基化，这在包括甲状腺癌的大多数肿瘤中已有报道。Rodríguez等[21]利用DNA甲基化阵列对甲状腺癌异常DNA甲基化的整体模式进行确定时，在非分化型甲状腺癌中发现四个潜在的原癌基因(INSL4、DPPA2、TCL1B和NOTCH4)经常受到低甲基化的调节。

3 甲状腺癌中甲状腺特异性基因甲基化

甲状腺特异性基因主要包括促甲状腺激素受体(TSHR)、钠-碘转运体(NIS)、甲状腺球蛋白(TG)和甲状腺过氧化物酶(TPO)基因，这些基因在甲状腺滤泡上皮细胞中特异表达，在吸收、浓缩和利用碘方面起重要作用。甲状腺特异性基因在甲状腺癌中的表达经常降低，虽然这些基因沉默的具体机制还不清楚，但是异常的DNA甲基化被认为是一个关键原因。Khan等[22]研究发现，甲状腺癌患者中TSHR基因甲基化率为25%(15/60)，其中伴有BRAF V600E突变的患者中TSHR甲基化率为73.3%(11/15)，说明BRAF V600E突变与TSHR甲基化有明显相关性，同时研究认为针对BRAF/MEK/MAP激酶途径为靶点的治疗可能是恢复甲状腺特异性基因表达的有效方法。Galrao等[23]在研究中发现了一种新的远端增强子，即NIS远端增强子，可通过DNA高甲基化使得甲状腺肿瘤中DNA表达降低，这可能是肿瘤发生的早期事件。TSHR及NIS的表达在甲状腺癌中经常丢失，引起碘吸收降低，最终导致甲状腺癌放射性碘治疗的失败。

4 DNA甲基化与甲状腺癌诊治

4.1 甲状腺癌诊断 随着对DNA甲基化认识的不断深入，利用DNA甲基化作为甲状腺癌早期诊断标志物的想法已不新鲜。通过检测这些DNA甲基化标记物，人们的目标是早期诊断甲状腺癌，并从分子水平上区分甲状腺癌亚型和甲状腺良性结节，减少甲状腺癌的过度诊断和手术。一项荟萃分析[24]显示，RASSF1A启动子甲基化与甲状腺癌的易感性和无病生存率密切相关，对RASSF1A甲基化水平的检测可用于甲状腺癌的临床诊断。Stephen等[25]应用甲基化定量PCR(QMSP)技术对甲状腺病变石蜡包埋组织(FFPE)中21个候选基因的启动子甲基化状态进行单独和组合分析，结果表明RASSF1A+TPO结合TPO+UCHL1的甲基化联合检测有助于鉴别FTC，RASSF1A+TPO甲基化组合有助于鉴别FA，TSHR甲基化检测可用于鉴别PTC。虽然单个基因甲基化检测的研究经常报道，但有些研究认为多个基因甲基化的联合检测更有利于提高标志物的灵敏度及特异度，增加甲状腺癌的诊断价值。

4.2 甲状腺癌治疗 鉴于甲状腺癌中相关基因高甲基化导致基因表达下调，使用改善这一变化的药物诱导沉默的基因重新表达是当前的一个研究方向。DNA甲基转移酶抑制剂是最早被认可的表观遗传药物之一，在某些甲状腺癌的治疗试验已经得到了报道。研究[26]发现，在PTC细胞中DNMT3A基因存在甲基化，通过去甲基化剂地西他滨处理后DNMT3A基因的表达得到了恢复。Vitale等[27]将地西他滨与依维莫司同时用于治疗甲状腺髓样癌(MTC)细胞时，发现联合用药明显提高了诱导细胞凋亡的能力，这为MTC和其他神经内分泌肿瘤的治疗开辟了一个新的方案。一项Ⅱ期科学试验研究了地西他滨能否恢复转移性DTC对131I的摄取，结果显示在使用地西他滨后，患者体内转移性DTC病灶的131I摄取恢复，但该试验同时存在的副作用不容忽视。已有的实验证据显示，去甲基化药物在肿瘤细胞系中的应用获得了有希望的结果，但是它们在临床试验中单独应用时则没有成功的案例，尽管如此，一些证据认为它们与其他药物的联合使用可能是一种潜在有用的治疗方法[28]。

5 结 语

表观遗传修饰，特别是DNA甲基化，在肿瘤发病机制中的作用已经逐渐清晰。许多研究阐明了DNA甲基化作为新的分子标记物在临床应用方面的潜力，DNA甲基化标记稳定，易在组织或体液中检测，对甲状腺癌的早期诊断、预后和治疗效果的预测具有重大价值。在治疗方面，根据DNA甲基化所开发的药物尚未能证明在甲状腺癌治疗中的有效性。由于DNA甲基化在甲状腺癌基础科学研究上还有许多不足，因此将其转化到临床应用中仍有许多工作要做。