恒温扩增芯片法在下呼吸道感染常见病原体检测中的临床应用

李素娟 汪环 徐丽娟 牛腊梅

【摘要】目的：研究在下呼吸道感染中恒温扩增芯片法对痰液样本中病原体检测的临床应用价值。方法：选取本院2019年11月至2020年1月间收集的143例下呼吸道感染患者，采用恒温扩增芯片法检测患者的痰液样本，同时以传统病原学检测方法（培养法）与之进行比较，判断其在临床应用中的价值。结果：采用恒温扩增芯片法和培养法共检测了143例下呼吸道痰液样本，其中，总体恒温扩增芯片法的阳性检出率61.54，高于病原分离培养的检出率25.87%。两种方法的检测结果一致性为64.34%，其中，肺炎克雷伯菌（Kappa=0.848）和金黄色葡萄球菌（Kappa=0.632）的检出情况在两种方法下的一致性较高。结论：相较于传统培养法，恒温扩增芯片法可以快速地检测常见病原体，检测时间短，且检测结果更加灵敏，阳性率更高，可以辅助临床快速、准确判断下呼吸道感染的致病原，有针对性地用药和治疗。

【关键词】恒温扩增芯片法;LAMP;培养法

[中图分类号]R446.5：R56 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）01-0142-03

下呼吸道感染（lower respiratory tract infections，LRTIs）是一种临床上的常见病、多发病[1]，严重威胁着人类的健康，由于大气污染、人口老龄化、吸烟等多种因素，数据显示成人死亡中下呼吸道感染者约占3%～5%[2]，居高不下的发病率和死亡率居给社会造成了巨大的经济负担。下呼吸道感染疾病可感染的病原体类型多样，包括细菌、病毒、非典型病原体等。复杂的疾病类型加上多样的病原体，导致临床上普遍存在着对LRTIs确诊难、用药难的情况，因此，在治疗LRTIs方面，及早明确病原体是极为关键的[3]。本研究采用恒温扩增芯片法与传统病原菌培养法，对143例LRTIs疑似患者进行了病原检测，初步了解新型的恒温扩增芯片法在临床上的应用价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年11月至12月在兰州市第一人民医院就诊的143例LRTIs患者，其中男80例（55.9%，80/143）、女63例（44.1%，63/143），采集深部痰液样本作为研究对象，年龄2～93岁，临床诊断主要为发热、咳嗽咳痰或咳血、社区获得性肺炎、支氣管肺炎、急性支气管炎、慢性肺心病等常见下呼吸道感染疾病。

1.2 仪器和试剂 试剂来源于北京博奥生物研发的呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法），该试剂盒检测结果由博奥生物集团有限公司研发的RTisochipTM-A恒温扩增芯片核酸分析仪进行分析。低速离心机（用于离心恒温扩增芯片）、200μL离心管、微量移液器（规格：10～100μL）以及各种规格的离心架都是本实验室配置。

1.3 方法 ①恒温扩增芯片法：按照试剂盒的要求采集所有患者痰液标本，同时处理样本并提取核酸，运用微流控芯片、恒温扩增技术，利用具有链置换功能的聚合酶在65℃恒温条件下进行反应，应用荧光染料掺人法进行实时荧光检测，扩增阳性的样品会产生类似实时荧光恒温的“S”形扩增曲线，一步完成对靶基因的扩增和检测。应用核酸分析仪展开分析，一步完成检测13种常见下呼吸道病原菌，包括流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌复合群等[4]。

1.4 统计学分析 数据使用SPSS21.0统计学软件分析和处理，用x2检验、例（%）表示计数指标，当P<0.05，说明差异显著。采用Kappa分析一致性，在Kappa>0.4的情况下表示检验结果具有一致性。

2 结果

2.1 分析恒温扩增芯片法 检出下呼吸道感染常见病原体的情况在143例痰液标本中，共检出88例呼吸道病原体阳性标本，整体阳性率为61.54%（88/143）。单种病原体感染样本49例（55.68%，49/88），混合感染样本39例（44.32%，39/88），其中以肺炎支原体、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌及流感嗜血杆菌混合感染占多数。88例阳性标本中检出12种共134株呼吸道病原体，其中检出率占比前三位的分别为流感嗜血杆菌占32.84%（44/134），肺炎链球菌占26.12%（35/134），肺炎支原体占14.18%（19/134）。本次样本中未检出嗜肺军团菌，详见表1。

2.2 细菌培养法 对下呼吸道感染常见病原体的检出情况143例的痰液标本中，采用传统培养法进行培养，其中37例标本培养出病原体，整体阳性率25.87%（37/143），其中单种病原感染样本32例（86.49%，32/37），混合感染样本仅5例（13.51%，5/37），包括4例肺炎链球菌和其他病原体的混合感染，以及1例鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌的混合感染。同时，37例阳性标本中共检出9种40株常见的病原体，其中检出率占比前三位的分别为流感嗜血杆菌占25.00%（10/40）、肺炎链球菌占30.00%（12/40）、金黄色葡萄球菌占17.50%（7/40），详见表2。

2.3 恒温扩增芯片法与培养法 对下呼吸道常见病原体检出情况的结果比较对共计143例样本同时进行了恒温扩增芯片法与培养法的检测，结果显示：恒温扩增芯片法检测出病原体阳性的样本共88例，总阳性率为61.54%（88/143），远高于培养法的检测阳性率25.87%（37/143）。其中，芯片法与痰培养两组结果均阳性37例，阴性55例，50例芯片法检测阳性、痰培养结果阴性，1例芯片法检测阴性、痰培养阳性。两种检测结果的一致性为64.34%（92/143），阳性符合率为25.87%（37/143），阴性符合率为38.46%（55/143），差异有统计学意义（x2=23.657，P=0.000），详见表3。

而对于不同种病原菌的检出情况比较，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌在两种检测方法中的一致性都较高;其中，检出一致性较好的前三位分别为肺炎克雷伯（Kappa值为0.848）、金黄色葡萄球菌（Kappa值为0.623），耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Kappa值为0.579）;嗜麦芽窄食单胞菌在两种方法中都是在混合感染中被检出，并且不具备一致性。

3 讨论

本項研究采用的主要方法是恒温扩增芯片法，该检测方法是将微流控生物芯片技术和环介导等温扩增技术相结合。因该检测技术不需要模板的变性、退火的温度变化过程，1h内可完成检测，可大大缩短检测周期[6]。

本研究结果表明恒温扩增芯片法检测病原体阳性的样本共88例，其中混合感染占39例，总阳性率为61.54%（88/143），远高于培养法的检测阳性率25.87%（37/143）。本研究结果也与之前的研究报道门类似，而从方法学本身的比较中可推论，恒温扩增芯片法较传统培养法病原体检出率高的原因可能在于：（1）传统病原体培养对于样本来源、样本条件、操作要求等多方面要求较高，导致阳性率不高;（2）恒温扩增芯片法能够从极微量的病原体遗传物质中进行拷贝和扩增，检测灵敏度较高;（3）有些病原体，比如流感嗜血杆菌，服药后，培养阳性率会降低。可以看出，两种方法的阳性和阴性符合率都比较低，一致性也不高，这可能与传统痰液培养法病原体检出率较低及部分病原菌无法培养、培养周期较长等因素相关[s]o

对本院的下呼吸道病原体分布情况进行统计得出，本研究中的88例阳性标本中检出12种共134株呼吸道病原体，其中检出率占比前三位的分别为流感嗜血杆菌占32.84%（44/134），肺炎链球菌占26.12%（35/134），肺炎支原体占14.18%（19/134）与文献报道基本吻合。此次研究的样本绝大多数是来自儿科的样本，共检出19例肺炎支原体和3例肺炎衣原体，肺炎支原体的检出率为14.18%，排在第三位，与文献报道情况吻合。对于支原体、衣原体等非典型病原体，是无法通过培养法进行检测的，说明恒温扩增芯片法在非典型病原体感染的诊断中有更好的应用价值。

综上所述，相较于传统培养法，恒温扩增芯片法可以快速地检测常见病原体，检测时间短，且检测结果更加灵敏，阳性率更高，可以辅助临床快速、准确判断下呼吸道感染的致病原，有针对性地用药和治疗。

参考文献

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[8]王咏红，郭雅洁，陈玉莹，等.恒温扩增芯片法在儿童下呼吸道感染性疾病中的应用价值评估[J].中国循证儿科杂志，2018，13（3）：176-179.