扩张型心肌病心肌纤维化与β-链蛋白表达相关性的初步分析

朱 庆 赵艳丽 韩丽媛 连国亮 卜雯婧 陈 东

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一种以心腔(左心室和/或右心室)扩大、心肌收缩功能障碍为主要特征的一类有相似表现的心肌疾病，病因不一，且有的病因尚不明。 是导致心力衰竭的较常见疾病之一[1]。 DCM 除心肌细胞变性外，还常伴有心肌间质胶原异常增生和堆积。 胶原增生并将心肌细胞包绕分隔，严重损害DCM 的心脏功能。研究认为β-链蛋白(β-catenin)是Wnt 信号通路上的重要信号分子，且与纤维化有紧密关连[2]。 本研究拟通过病理形态观察及免疫组化技术检测DCM，探讨β-catenin 蛋白表达与心肌纤维化的关系。

资料与方法

1.病理材料来源 病例选自首都医科大学附属北京安贞医院2015 年至2018 年心脏移植获得的临床、超声、病理诊断为扩张型心肌受体心脏(DCM组)和法医尸检获取的正常心肌对照，各15 例。DCM 组心肌取自移植心脏左心室灰白区及灰红区心壁，对照组心肌选自正常心脏左心室心肌，每例取6～10 块组织。 研究通过首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会批准。 DCM 组及对照组组织材料均用10%甲醛充分固定，常规技术样品处理，石蜡包埋，制作成6 μm 切片，再经不同染色或免疫组化处理，供不同应用。

2.标本处理方法 (1) 苏木素-伊红染色(HE染色) 切片供观察心肌的病理形态特征:并用3DHISTECH 切片扫描仪扫描记录和观察其病理形态特征。

(2)免疫组织化学染色(IHC)及免疫组化半定量检测法研究心肌内β-catenin 蛋白的表达:将DCM组及对照组的切片，加200 μL 封闭液，在室温下封闭1 h，加入200 μL 的一抗，4 ℃孵育过夜，滴加酶标二抗，在室温下孵育30 min；经苏木精复染后封片；用3DHISTECH 切片扫描仪扫描后观察两组心肌 内 β-catenin 蛋 白 的 表 达 情 况； 在 扫 描 仪CaseViewer 软件内截取400×放大倍数下IHC 切片内DCM 组纤维化区、非纤维化区及对照组6 个不同区域的心肌β-catenin 蛋白表达，使用ImageJ 软件测量β-catenin 蛋白区域的平均光密度(average optical density， AOD)＝积分光密度值(integrated density，IOD)/阳性面积(Area)代表该区域下β-catenin 蛋白表达强度，取AOD 的平均值代表该例标本不同区域的β-catenin 蛋白表达强度。

(3)用Masson 染色显示心肌纤维化的程度:将DCM 组及对照组石蜡标本的石蜡切片，

用Weigert 苏木素染5 ～10 min，丽春红酸性品红溶液染5～10 min，磷钼酸溶液处理约5 min，苯胺蓝染液复染3 min，1%冰醋酸水溶液冲洗，脱水、透明、封片；用3DHISTECH 切片扫描仪扫描后观察两组心肌纤维化情况；在扫描仪CaseViewer 软件内截取200×放大倍数下随机选取Masson 染色切片内实验组纤维化区、非纤维化区及对照组各20 个心肌区域(除去心内膜、心外膜区)，用ImageJ 软件测量纤维化区域面积S1/心肌区域面积S2 的比值代表该区域的纤维化程度，取比值的中位数代表该例心肌标本的纤维化程度[3]。

3.统计学方法 使用SPSS21.0 进行统计学分析。 计量资料以均数±标准差表示；采用单因素方差分析分析，两两比较采用LSD 法；用配对样本t 检验比较DCM 组纤维化区与非纤维化区两组间βcatenin 蛋白表达及纤维化程度差异；用独立样本t检验比较实验组与对照组β-catenin 蛋白表达及纤维化程度的两两差异；β-catenin 及心肌纤维化程度的相关性采用Pearson 相关性分析，相关系数为0.8～1.0 极强相关，0.6～0.8 强相关，0.4 ～0.6 中等程度相关，0.2～0.4 弱相关，零～0.2 极弱相关或无相关。 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.两种心肌的病理形态学分析及β-catenin 蛋白免疫组化染色分析 HE 染色及Masson 染色的组织病理形态见DCM 组心肌细胞对比正常组心肌细胞表现为心肌细胞体积增大、外形伸长，核增大，核深染，核膜出现沟裂、迂曲或皱褶，心肌细胞间质纤维化，纤维化区心肌细胞可见空泡及玻璃样变性伴心肌细胞萎缩，活动期纤维化区成纤维细胞及间质小血管增生，可见散在个别慢性炎症细胞浸润；静止期纤维化区成纤维细胞减少，被大量纤维替代，周围可见萎缩的心肌(图1～2)；其中1 例纤维化区域周围伴大量淋巴细胞为主的炎症细胞浸润(图3)。DCM 心肌纤维化病例的纤维化区分布不均匀，部分以近心外膜和心内膜处较密集，部分发生于心壁内的纤维化主要沿间质血管分布，并以血管为中心向周围穿插排列(图4～5)。

图1 DCM 心肌细胞肥大，核增大，纤维化由血管周围开始向邻近心肌细胞间伸展，活动期纤维化周围心肌变性、萎缩，成纤维细胞增生(绿色箭头)，散在淋巴细胞浸润(红色箭头)(HE 染色)；图2 对照组正常心肌细胞及血管周围无明显纤维化(HE染色)；图3 DCM 纤维化区域内可见较多慢性炎症细胞浸润(HE 染色)；图4 DCM 心内膜、心外膜及血管周纤维化(Masson 染色)；图5 正常组心肌间质无大片纤维化(Masson 染色)；图6 活动期纤维化区成纤维细胞表达β-catenin 蛋白(绿色箭头)，周围退变心肌内β-catenin 蛋白在细胞质内弥漫表达(红色箭头)(IHC 染色)；图7 静止期纤维化区成纤维细胞内β-catenin 蛋白表达减少或不表达(红色箭头)，周围心肌胞质内β-catenin 蛋白表达减少，局灶可出现蛋白聚集(绿色箭头)(IHC 染色)；图8 非纤维化区域心肌闰盘β-catenin 可表达升高，胞质内蛋白颗粒状表达(红色箭头)(IHC 染色)；图9 对照组正常心肌内仅有部分β-catenin 蛋白在闰盘弱表达(IHC 染色)

β-catenin 在心脏中表达于心肌细胞闰盘、血管内皮细胞、成纤维细胞。 β-catenin 在DCM 中间质纤维不表达，纤维化周围区心肌细胞闰盘β-catenin表达升高，呈不规则块状染色，DCM 组13 例纤维化较重区域的周围心肌内β-catenin 蛋白有较密集表达；在活动期纤维化区，可见成纤维细胞表达βcatenin 蛋白，周围退变心肌内β-catenin 蛋白在心肌细胞质内弥漫表达(图6)；静止期纤维化区成纤维细胞内β-catenin 蛋白表达减少或不表达，周围心肌胞质内蛋白表达减少(图7)；非纤维化区域心肌闰盘β-catenin 可表达升高，呈粗线状染色，部分也可呈块状但不常见(图8)。 在DCM 组中，β-catenin 除在闰盘处表达外，在细胞质中也可出现颗粒状表达、染色加深并沿肌丝分布于心肌细胞核两侧的细胞质内；而正常组内心肌细胞闰盘β-catenin 蛋白呈线状染色，仅5 例出现β-catenin 蛋白集聚，而细胞胞质内未出现蛋白颗粒(图9)。

2.免疫组织化学法及特殊染色法检测β-catenin蛋白表达情况及心肌纤维化情况

(1) DCM 组纤维化区、非纤维化区与对照组βcatenin 蛋白表达的AOD 比较DCM 组纤维化区、非纤维化区与对照组β-catenin 蛋白表达的AOD 总体，差异有统计学意义(P ＝0.01)； DCM 组纤维化区与对照组心肌β-catenin 蛋白表达AOD 差异有统计学意义(t ＝3.047，P ＝0.009)，DCM 组非纤维化区与对照组心肌β-catenin 蛋白AOD 表达也差异有统计学意义(t ＝2.626，P ＝0.014)，DCM 组纤维化区与非纤维化区蛋白表达AOD 差异无统计学意义(t＝1.372，P ＝0.192， 表1)。

图10 A:组心肌纤维化区β-catenin 与心肌纤维化程度的相关性；B:DCM 组心肌非纤维化区β-catenin 与心肌纤维化程度的相关性；C:对照组β-catenin 与心肌纤维化程度的相关性

表1 三组β-catenin 及纤维化程度S1/S2 比较¯

表1 三组β-catenin 及纤维化程度S1/S2 比较¯

组别 β-catenin AOD S1/S2 DCM 组纤维化区(n＝15) 0.59±0.13 0.57±0.07 DCM 组非纤维化区(n ＝15) 0.56±0.11 0.26±0.08对照组(n ＝15) 0.47±0.09 0.30±0.05 F 值 5.17 91.33 P 值 0.01 ＜0.001

3.DCM 组纤维化区组织、非纤维化区与对照组纤维化区域面积S1/心肌区域面积S2 比值的比较

DCM 组纤维化区、非纤维化区与对照组S1/S2 值差异有统计学意义(P＜0.001)； DCM 组纤维化区与非纤维化区S1/S2 值差异有统计学意义(t ＝10.124，P＜0.001)；DCM 组纤维化区与对照组S1/S2 值差异有统计学意义(t ＝12.051，P＜0.001)；但DCM 组非纤维化区与对照组S1/S2 值差异无统计学意义(t＝-1.455，P ＝0.157，表1)。

4.β-catenin 蛋白在DCM 组与对照组心肌中与心肌纤维化的相关性分析 DCM 组纤维化区βcatenin 蛋白AOD 与心肌纤维化区纤维化程度(S1/S2)呈明显正相关(r ＝0.681，P ＝0.005)；DCM 组非纤维化区β-catenin 蛋白AOD 与心肌非纤维化区纤维化 程 度(S1/S2) 无 相 关 性(r ＝- 0.501，P ＝0.057)；对照组纤维化区β-catenin 蛋白AOD 与心肌纤维化程度(S1/S2)无相关性(r ＝-0.023，P ＝0.935，图10)。

讨 论

心肌间质纤维化是DCM 心肌的主要特征之一，心肌细胞间及血管周围纤维化，是DCM 的典型病理表现[4]。 本研究表明，DCM 非纤维化区与对照组的β-catenin 蛋白表达并无明显统计学差异，表明DCM心肌纤维化主要围绕血管呈局灶及片状，而非整体心肌细胞间质均发生广泛纤维化。 纤维化区周围心肌可见心肌细胞变性、萎缩，纤维化区周围可见散在的慢性炎症细胞浸润，可能与下面将要讨论的βcatenin 的作用相关。 本实验中DCM 纤维化需与限制性心肌病纤维化相鉴别，具有嗜酸细胞增多症的限制性心肌病可出现心内膜心肌纤维化、Löffer 心肌炎，而无嗜酸细胞增多症的限制性心肌病可出现灶片状或弥漫的纤维化，但心内膜无纤维化改变。

β-catenin 蛋白作为Wnt /β-catenin 信号通路的重要组成部分，在体内各器官的纤维化病变中均具有重要作用。 刘金娟等[5]发现， 硬皮病小鼠皮肤组织中β-Catenin 蛋白增加，认为Wnt/β-Catenin 通路影响皮肤的纤维化病变。 He 等[6]发现， 慢性肾损伤中Wnt /β-catenin 通路激活将导致β-catenin 累积并诱导下游靶基因表达。 反映了Wnt /β-catenin信号通路过度激活会促进肾间质纤维化。 Ge 等[7]研究发现，肝纤维化程度与β-catenin 表达水平呈正相关，沉默β-catenin 蛋白可抑制胶原分泌和肝星状细胞增殖，介导细胞凋亡。 而在心脏的心肌纤维化中，β-catenin 及其所在的Wnt/β-catenin 通路亦起着重要的作用，心外膜细胞和心脏成纤维细胞也有Wnt 反应，Wnt1 在体外诱导β-catenin 依赖性心外膜上皮细胞-间充质转化(EMT)，促进心脏成纤维细胞增殖[8]。

在各种心脏的纤维化病变中，β-catenin 蛋白通常表达升高并认为与心肌纤维化关系密切。 Roberts等[9]研究发现，与β-catenin 增多相关的AnkB 功能丧失的小鼠模型在10 周龄时出现显着的结构异常，包括显着的双心室扩张，纤维化和射血分数减少。Lin 等[10]在心肌梗塞(MI)患者的心肌及相关动物模型中检测到β-catenin 蛋白在瘢痕区间质内表达升高并浓缩。 在我们的实验中，β-catenin 的表达于成纤维细胞内、血管内皮细胞、心肌的闰盘或附近；纤维化活动期成纤维细胞β-catenin 表达明显稍强于纤维化静止期，周围退变心肌内β-catenin 蛋白在心肌细胞质内弥漫表达，DCM 心肌细胞内β-catenin蛋白普遍较正常组高，纤维化区与非纤维化区并无差异，表明DCM 的心肌纤维化与心肌梗塞(MI)成因不同，我们推测DCM 的病因多样，为广泛的非直接损伤，如遗传、免疫、病毒感染等，不同于MI 由于缺血而导致的局部心肌损伤所致。

研究表明β-catenin 是细胞表面钙粘蛋白蛋白复合物的亚基，可被多种致病因素激活。 Wnt /βcatenin 的持续活化与纤维化疾病的发病机制有关。Yu 等[11]研究表明，在许多由上皮间质转化介导的纤维增生性疾病中，有β-catenin 核异位表达，Lin等[10]的动物及细胞实验发现转染心肌细胞猪巨细胞病毒(pCMV)-β-catenin 蛋白质粒过表达βcatenin 蛋白，转录因子在患有心源性高血压的Wistar 大鼠中显示核定位，转染β-catenin 蛋白质粒以剂量依赖性方式诱导心肌细胞凋亡并降低存活途径标志物的表达。 Haybar 等[12]研究发现，在缺血性心肌中，心脏损伤后Wnt /β-连环蛋白信号传导至心外膜，使得Wnt1 表达增加，成纤维细胞和肌细胞扩增，导致心肌纤维化，Wnt5a 在心肌梗塞后诱导IL-6 并引起成纤维细胞和炎症的相互作用。 我们也观察到，DCM 患者纤维化区域内可以出现以淋巴细胞浸润为主的炎症性反应，但仅为个例，并非普遍，Kawai 等[13]研究证实，在动物模型中诱导小鼠心肌炎可发生扩张型心肌病。 我们观察到β-catenin 在DCM 心肌细胞内普遍升高，而不在心肌间质纤维化区，其原因是否与纤维化的成因等不同有关? 纤维化与纤维疤痕的病理有差别? 还有待研究及探讨。

在我们的研究中，观察到的β-catenin 蛋白在心肌细胞胞浆内表达及闰盘处聚集是很有趣的现象之一，通过结合形态学比对观察，纤维化区的一部分蛋白聚集表达可能和闰盘的变异相关，即β-catenin 蛋白表达随闰盘的变异增多，范围增宽；而在活动期纤维化区DCM 退变心肌胞浆中β-catenin 蛋白的颗粒状表达及聚集则可能是纤维化的潜在基础条件，目前研究[14-15]认为，一旦Wnt /β-catenin 通路被激活，β-catenin 就会稳定表达并转移到细胞核中，在那里与T 细胞因子/淋巴增强子结合因子结合，刺激靶基因的转录，包括纤维化相关的基因表达。 βcatenin 在细胞质中积累并引起Wnt 靶基因的转录激活，缺乏Wnt 配体，β-catenin 被泛素化并被靶向蛋白酶体降解，Wnt 信号被抑制，而在没有Wnt 刺激的情况下，细胞质β-连环蛋白水平通过降解复合物保持低水平，而我们观察到活动期纤维化区散在的慢性炎症细胞浸润，间接印证了相关研究。 因此βcatenin 的表达部位的变化及凝集可能象征着相关纤维化基因的表达，而其通过何种方式转移、纤维化与成纤维细胞、闰盘的关系也有待于进一步探索。

综上所述，本材料表明β-catenin 蛋白表达主要在心脏的闰盘及近旁、成纤维细胞，其含量增多与DCM 患者心肌纤维化程度呈正相关，在β-catenin 蛋白增加的基础上，β-catenin 蛋白的部位变化、炎症刺激等因素可能是DCM 患者心肌纤维化的主要因素。本研究印证了部分相关动物及细胞实验，并揭示了β-catenin 蛋白于DCM 与其他心脏病变中的类似及不同之处，探究了β-catenin 与心肌纤维化的关系，对于进一步的原因及相关分子通路机制还待进一步探索。