环状RNA在肺癌诊断及预后中的研究进展

刘德慧, 严玉兰

(1. 江苏大学临床医学院, 江苏 镇江, 212013; 2. 江苏大学附属人民医院 呼吸内科, 江苏 镇江, 212002)

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，其中85%为非小细胞肺癌[1]。中国的肺癌发病率和增长率始终居高不下，且肺癌患者的5年生存期相对较低，主要原因是缺乏早期筛查以及在治疗过程中出现进展、耐药和复发[2-3]。目前，急需一种高效且准确的方法对肺癌患者进行诊断及预后评估。环状RNA(circRNA)是一种具有闭合环状结构的RNA, 这种闭合环状结构使circRNA 具有高度的稳定性及保守性、普遍性、组织和疾病特异性等，这提示circRNA具有作为癌症诊断及预后评价的生物标志物的潜力。本文从肺癌组织与体液2个方面，对circRNA在肺癌诊断及预后评估中的作用与价值进行综述与分析，并对当前临床研究中存在的问题进行讨论。

1 circRNA的概述

SANGER H L等[4]通过电子显微镜发现了环状结构的RNA, 但当时普遍认为这种circRNA是pre-mRNA剪接过程中的副产物，不具有生物学功能。其后，随着高通量测序和生物信息分析技术的发展，相关研究[5]证实真核细胞包含成千上万个不同的circRNA, 可以稳定存在于组织、细胞及体液中，如血液、唾液、外泌体等，且circRNA的拷贝数可能是其相关线性RNA的10倍，表明circRNA 具有潜在的生物学功能。circRNA可以通过多种途径参与调控基因，包括小RNA(miRNA)的海绵作用[6]、与RNA结合蛋白(RBPs)的相互作用[7]、调节基因转录/剪接过程及翻译蛋白质[8-10]等。

2 肺癌组织中异常表达的circRNA

人类发现了超过100 000个不同的circRNA，而某些circRNA在肺癌组织中富集且异常表达[11]。研究[12]发现在非小细胞肺癌组织中表达水平上调的circRNA发挥着类似原癌基因的作用，可以促进非小细胞肺癌的增殖、迁移以及抑制肿瘤细胞凋亡等病理过程，即肿瘤促进circRNA(hsa_circ_0075930、circRNA_102231、hsa_circ_0014130、hsa_circ_0011385、hsa_circ_0013958、circ_0067934、hsa_circ_0001715等); 与之相反，在非小细胞肺癌组织中表达水平下调的circRNA发挥着类似抑癌基因的作用，可以抑制肿瘤细胞增殖[13]、迁移并促进凋亡[14-15], 即肿瘤抑制circRNA(circRNA_FOXO3、hsa_circ_0001073、hsa_circ_0077837等)。下文将从诊断准确性、临床特征、预后评估等方面对2类circRNA作为生物诊断标志物的可能性进行综述。

2.1 circRNA的诊断价值

通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线对肿瘤促进circRNA的诊断准确性进行评价，发现肿瘤促进circRNA具有良好的诊断价值。如hsa_circ_0075930的曲线下面积(AUC)为0.756(95%置信区间: 0.649～0.864;P<0.01)，灵敏度为76.2%、特异度为72.1%[16]。circRNA_102231的AUC为0.897, 灵敏度及特异度分别为81.2%、88.7%[17]。hsa_circ_0014130的AUC为0.878, 灵敏度与特异度分别为87.0%和84.8%[18]。至于肿瘤抑制circRNA, ZHANG Y N等[19]证实circRNA_FOXO3在非小细胞肺癌组织及细胞中下调，绘制ROC曲线后发现其AUC为0.782(95%置信区间: 0.682～0.862), 灵敏度为80.0%、特异度为73.3%。hsa_circ_0077837在肺腺癌及鳞癌中表达水平均下调，其AUC为0.921 (95%置信区间: 0.868～0.975)[17]。由此可见，在肺癌组织中，无论是肿瘤促进circRNA还是肿瘤抑制circRNA，二者均体现出良好的诊断价值，具有成为肺癌诊断生物标志物的潜力。

2.2 circRNA与临床特征

对于肿瘤促进circRNA，以其在组织中表达量的中位数为节点，将患者分为相对高表达组与低表达组进行统计学分析，研究发现高表达水平的hsa_circ_0075930与肿瘤的大小(P=0.001)及淋巴结转移(P=0.038)有关[16]; hsa_circ_0014130的高表达与TNM分期(P=0.001) 及淋巴结转移(P=0.004)有关[18]; circRNA_102231的表达水平与晚期TNM分期(P=0.024)及淋巴结转移(P=0.009)有关[17]; circRNA_100876的高表达与淋巴结转移阳性(P=0.001)及肿瘤分期(P=0.001)有关[20]。由此表明肿瘤促进circRNA 的高表达与淋巴结转移及肿瘤分期存在着一定的联系。另一方面，对于肿瘤抑制circRNA而言，在非小细胞肺癌组织中下调的circ_0001649, 当其表达水平较低时，预示着可能存在淋巴结转移(P=0.029)及患者当前处于肿瘤晚期(P=0.010)。不管是肿瘤促进circRNA还是肿瘤抑制circRNA, 其表达水平与肿瘤的淋巴结转移及TNM分期存在一定关联，这也意味着目的circRNA具有成为一种指导肿瘤分期以及提示淋巴结转移的生物标志物的潜力。

2.3 circRNA与肿瘤分型

WANG C D等[21]研究发现hsa_circ_0001073仅在腺癌组织中表达下调，而hsa_circ_0001495仅在鳞癌组织中上调，分别绘制ROC曲线后发现, hsa_circ_0001073对腺癌诊断的AUC为0.919, hsa_circ_0001495对鳞癌诊断的AUC为0.965, 这意味着hsa_circ_0001073和hsa_circ_0001495能作为非小细胞肺癌分型的生物标志物, 具有鉴别鳞癌与腺癌的潜力。

2.4 circRNA与肿瘤预后

对于肿瘤促进circRNA而言, ZOU Q G 等[22]通过Kaplan-Meier生存曲线和log-rank 检验对总体生存时间进行分析，发现组织中circ_0067934高表达的患者与低表达组相比通常预后不佳。同时运用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析发现, circ_0067934可作为影响非小细胞肺癌患者总体生存期的独立危险因素。此外, ZONG L等[17]研究发现circRNA_102231高表达患者的预后(中位生存期为26个月)比低表达者(中位生存期为43个月)更差。此外，有学者[23]研究发现hsa_circRNA_103809在顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞系中表达水平显著上调，具有评估肺癌患者治疗效果的生物标志物的潜力[24]。相关研究[25-26]证实hsa_circ_003099在肺癌组织及细胞中低表达，生存分析研究显示其表达水平愈高预示着更长的生存时间，且与紫杉醇的耐药有关。

3 外周血游异常表达的游离circRNA

外周血细胞外游离的circRNA即不同组织细胞分泌进循环血液中的circRNA。circRNA得益于独特的闭合环状结构、对RNA水解酶不敏感、外泌体囊泡的保护作用等因素，可稳定存在于体液中，如血浆，血清，唾液，外泌体等[27], 故液体活检检测circRNA可能成为无创诊断肿瘤生物标志物[28]。作者现分别对血浆/血清中的circRNA及外泌体中的circRNA对肺癌的诊断及预后价值进行分析。

3.1 血清/血浆中的circRNA

液体活检因其无创性、可重复性在临床应用中越来越广泛，但目前肺癌分子水平检测主要是血清肿瘤标志物、肺癌自身抗体等，在临床实践中的表现均不甚理想，临床上仍以病理活检为诊断金标准。circRNA的出现为液体活检在肿瘤诊断及疗效评价中的应用提供了新方向。

3.1.1 circRNA与肿瘤诊断及临床特征: 研究发现肺癌患者血浆中的hsa_circ_0001715的表达显著上调(P<0.001), 其AUC为0.871(95%置信区间: 0.807～0.936), 其中灵敏度、特异度及准确性分别为87.72%、71.67%及79.49%, 显示出较好的诊断价值; 其可作为一种独立的预后评估因素，血浆中hsa_circ_0001715的表达水平越高表明生存时间越短[29]。研究[30]发现circPVT1在肺癌患者血清中表达上调，其AUC为0.794, 灵敏度为71.1%、特异度为80.0%, 提示血清中的circPVT1具有作为诊断非小细胞肺癌的生物标志物的潜力。在临床特征方面, LUO Y H等[31]发现，肺癌患者血浆中hsa_circ_0000190表达量与肿瘤体积(P<0.000 1)、恶性程度(P=0.002 8)、TNM分期晚期(P< 0.000 1)以及远处(P=0.003 9)及胸外转移(P=0.000 4)呈正相关，其表达水平上调可能预示着生存时间更短(P=0.047)。由此可见，血浆/血清中的circRNA在肺癌的诊断、临床分期方面有着重要的价值。

3.1.2 circRNA与疗效评价: TAN S Y等[28]发现F-circEA仅在EML4-ALK融合基因患者的血浆中表达，推测其可作为非小细胞肺癌液体活检的生物标志物。实验及统计学分析证实，血浆中hsa_ circ_0086414的表达水平与EGFR突变有关(P=0.001), 具有指导治疗与监测疾病进展的作用; hsa_circ_0000190的表达水平与肿瘤中程序性死亡受体(PD-L1)有关(P< 0.000 1)[31]，具有评估治疗效果的作用。此外，在免疫治疗患者的长期随访[32]中发现，血浆中hsa_circ_0000190高表达患者全身治疗及免疫治疗效果更差(P=0.000 2, 0.005 8)。血浆中hsa_circ_0005962的表达水平在治疗前后有显著差异。血浆或血清中的目的circRNA可作为评估疾病进展及疗效的一种无创性监测指标。

3.2 外泌体circRNA

外泌体为一种自然生物运载纳米粒子，其囊泡可以携带蛋白质、核酸如mRNA、微小核糖核酸(miRNA)、circRNA等[33]。表明血浆或者血清来源外泌体中的circRNA可作为一种高效且非创伤的诊断癌症及评价预后的生物标志物[34]。

3.2.1 circRNA与鉴别诊断及临床特征: 研究[35]通过对非小细胞肺癌患者及正常对照组外泌体中circRNA进行高通量测序，发现3种circRNA的表达具有显著差异(circ_0047921、circ_0056285、circ_0007761)。其中circ_0047921可有效鉴别慢性阻塞性肺疾病及非小细胞肺癌(AUC=0.890, 95%置信区间: 0.831～0.902)。而circ_0056285与circ_0007761可有效联合鉴别出非小细胞肺癌与结核病(AUC=0.820, 95%置信区间: 0.739～0.902), 且circ_0056285的表达与临床分期及淋巴结转移相关。血浆外泌体中hsa_circ_0056616的表达水平上调对发生淋巴结转移的肺腺癌患者具有一定诊断意义，其AUC为0.812(95%置信区间: 0.720～0.903), 灵敏度及特异度分别为0.792、0.810[36-37], 这使其可作为一种评估淋巴结转移的预测因子。WANG J等[38]发现在血清来源外泌体circRNA_002178中，通过外泌体与CD8+T淋巴细胞相互作用，诱导PD-L1/PD-1在肺腺癌中的表达，并且其对肺腺癌的诊断具有一定价值(AUC=0.995 6,P<0.001)。

3.2.2 circRNA的疗效评价: 三代EGFR-TKI药物奥希替尼(泰瑞沙)为EGFR突变的晚期非小细胞肺癌治疗的一线用药，但在临床应用中部分患者表现出不敏感甚或出现耐药，MA J等[39]研究发现hsa_circ_0002130在抵抗的非小细胞肺癌细胞中高表达，通过体内外实验证实耗竭hsa_circ_0002130 能够抑制奥希替尼的抵抗作用，并依此推测在血清来源外泌体中表达水平同样上调的hsa_circ_0002130可作为一种评估奥希替尼对非小细胞肺癌的治疗效果的生物标志物。血清外泌体来源的circRNA可作为一种评估肺癌治疗效果的生物标志物。

4 存在的问题

将circRNA作为生物标志物应用于肺癌诊断，仍具有以下问题。尽管circRNA以其高度器官组织特异性得以成为一种极具潜力的生物标志物，但当前的研究亦不能证明候选circRNA的敏感性优于已知的肿瘤经典血清生物标志物，如CEA、NSE等。与组织活检相比，液体活检具有无创性和可重复性的优点，然而circRNA在体液中的含量较低，外周血和外泌体的研究临床数据有限，且多数circRNA还没有在大样本中显示出优秀的预后或诊断意义，虽然大多数circRNA在组织及血液中的表达水平具有一致性[40], 但一些circRNA在组织与全血中的表达可能存在差异，甚至存在相背的情况[41, 29], 因此在研究时需要对组织及血液中circRNA的表达水平进行综合评估。现今对circRNA诊断及预后的研究主要是通过meta分析等进行评价，这使结果存在一定的局限性，比如受限于研究样本，没有根据不同的circRNA进行亚组分析等。

5 展望

circRNA因其高度的稳定性、保守性、普遍性、组织和疾病特异性，有望成为一种新的肿瘤生物标志物。通过对肺癌患者肿瘤组织中及循环中游离的circRNA进行综述，提示circRNA在诊断准确性、临床分期、鉴别诊断、预后及治疗反应评价等方面有重要意义与价值。在候选circRNA中寻找具有高度特异性及敏感性的肺癌生物标志物，通过将其与其他生物标志物或影像学检查相结合，或许可以提高诊断准确性和特异性，可减少有创操作，同时有助于解决现有肿瘤标志物的低器官特异性等问题。当前研究证实circRNA不仅对临床工作中肺癌的诊断及预后评估有一定的帮助，对于降低肺癌的死亡率及生抗肿瘤药物的研发也具有深远意义。此外，还需要进一步深入研究和验证目的circRNA作为生物标志物在临床实践中的有效性，以及在肺癌的生理过程中发挥的作用与机制。相信在不久的将来 circRNA 会在肺癌的诊断和预后评估中发挥越来越重要的作用。