基于网络毒理学研究莠去津对精子顶体反应的毒性作用

方翔永

（河北大学生命科学学院，河北 保定）

0 引言

在有性生殖的过程中，精子和卵子结合成受精卵，并携带了双亲的遗传信息，保证了遗传的稳定性。在形成受精卵之前，精子会发生顶体反应。顶体反应（Acrosome reaction, AR）是受精前的重要步骤，并与精子获能、精卵识别与融合等[1]过程相关。目前，精子发生顶体反应涉及到各种精子膜蛋白，如hSMP 为人类重要的精子膜蛋白，Cheng 等[2]运用hSMP 抗体作用于小鼠精子，发现该抗体可以抑制小鼠的顶体反应和精卵结合过程。并且顶体反应涉及到了多条信号通路，如泛素-蛋白酶体途径[3]、磷酸肌醇依赖性途径[4]等途径。此外，有研究表明精子发生顶体反应还依赖于Ca2+浓度，并涉及到多条互补的信号通路[5]。

莠去津（Atrazine）最初是作为一种除草剂，目前也公认该物质为环境内分泌干扰物，可对不同物种产生毒性作用，并且其毒性作用体现在不同方面。Aurore 等[6]发现莠去津能干扰雄性小鼠的精子减数分裂过程，Huang 等[7]研究表明莠去津可以破坏DNA 双链的形成。本实验室在前期主要以中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）为材料，通过研究中华绒螯蟹精子，揭示出莠去津对精子中的乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶均呈现倒“U”形毒性效应，即莠去津在中间浓度时毒性最强[8]。

网络毒理学是基于网络药理学发展起来的一项生物信息学技术，通过检索毒性物质作用靶点和所要作用的组织靶点，并取交集可得到毒性物质作用于特定组织的靶点信息。目前，常用的网络毒理学数据库为TOXNET（https://toxnet.nlm.nih.gov/）数据库[9,10]，该数据库包括了一系列子数据库，如TOXLINE、CTD、IRIS 等，是目前最全面的网络毒理学数据库。

本研究通过网络毒理学的方法，用以揭示出莠去津对于人类精子顶体反应的毒性作用，探讨其作用靶点，并有利于今后通过实验证明莠去津抑制这些靶点，来探讨莠去津对精子顶体反应的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

从北京维通利华实验动物技术有限公司采购40 只性成熟雄性BALB/c 小鼠，体重约为(30±7)g，并常规适应性饲养7 天。

1.1.2 试剂

莠去津，由百灵威科技有限公司提供；M2 受精培养基，由Sigma 公司提供；精子活力试剂盒，由abcam 公司提供；石蜡油，异丙醇，75%乙醇，0.1M PBS 缓冲液，均由上海吉至生化科技有限公司提供；TRIzol 试剂，DEPC 水，Oligo（dT）(10mM)，Reaction Buffer，dNTP Mix，RibolockTM Rnase inhibitor，RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase,RNase Free water，以上试剂均由ThermoFisherScientific 公司；莠去津各作用靶点的上下游PCR 引物，均由上海伯豪生物技术有限公司合成。

1.1.3 设备

高速冷冻离心机，由Sigma 公司提供;PCR 仪，由Applied Biosystems 公司提供；Step One TM Software v 2.1 扩增仪，由北京东迅天地医疗仪器有限公司提供；倒置显微镜，由Olympus 公司提供。

1.1.4 数据库及软件

TOXNET（https://toxnet.nlm.nih.gov/）数据库、CTD 数 据库（http://ctdbase.org/）、Genecards（https://genecards.weizmann.ac.il/）数据库、Cytoscape3.2.1、Cytoscape3.2.1 中的ClueGo 插件。

1.2 方法

1.2.1 查询和筛选莠去津作用靶点

登录TOXNET 数据库，选择CTD 子数据库，因TOXNET数据库中的靶点信息不全，故需通过TOXNET 数据库进入CTD 数据库主页，选择“Gene-interaction”子选项，运用高级查询功能，在“Chemical”项中输入“Atrazine”，在“Organism”项中输入“Homo sapiens”，去除重复靶点信息，得到莠去津作用于人类的靶点信息。

1.2.2 查询人类精子顶体反应相关靶点

运用Genecards 数据库，在搜索框中输入关键词“Sperm+Acrosome reaction”，得到与人类精子顶体反应相关的靶点信息。运用Cytoscape3.2.1 软件中的ClueGo 插件分析收集到的人类精子顶体反应相关靶点的GO 生物学过程和KEGG 代谢通路。

1.2.3 整合靶点信息

将上述收集到的莠去津作用于人类的靶点信息与人类精子顶体反应相关的靶点信息取交集，得到莠去津作用于人类精子顶体反应的靶点信息，并整理成Excle 表格。

1.2.4 靶点通路分析

运用Cytoscape3.2.1 软件中的ClueGo 插件对整合得到的靶点信息进行GO 生物学过程和KEGG 代谢通路分析，得到这些整合的靶点信息所涉及的生物学过程。

1.2.5 动物实验

经7 天适应性饲养后，随机将小鼠分为空白组、低剂量莠去津组、中剂量莠去津组和高剂量莠去津组，每组各10 只，其中空白对照组灌胃蒸馏水0.3mL/只，低剂量莠去津组、中剂量莠去津组和高剂量莠去津组分别按照莠去津100mg/kg、200mg/kg 和300mg/kg 的标准配置莠去津溶液，并分别灌胃各莠去津溶液0.3mL，以上各组均处理15 天。

1.2.6 检测精子顶体反应率[11]

15 天处理完后处死小鼠，并取小鼠附睾末端在37℃下置于0.1M PBS 缓冲液中30min，随后将附睾置于M2 受精培养基中，配制浓度为5×106精子/mL，于37℃条件下处理2h，并滴加石蜡油，使用精子活力试剂盒，根据说明书进行操作，检测精子活性来反应精子顶体反应率。

1.2.7 实时定量PCR 方法检测莠去津作用靶点的mRNA 表达情况

将收集到的小鼠附睾置于液氮中保存，加入1mL TRIzol，离心10min；取 上清，加入 0.2mL 氯仿, 离心15min；取 上清,加入 0.5mL 异丙醇，离心10min；去上清，在沉淀中加入1mL 75 ℅乙醇（DEPC 水配制）,离心5min，去上清，室温干燥；加入20-50 μL DEPC 水, 促溶，-80℃保存备用；以上各部离心条件皆为4℃，12000rpm。在保存的样品中加入总 RNA（质量为1ug）、10μM Oligo（dT）1μL，加入DEPC水至12μL，混匀；置于PCR 仪上 65℃，5min，冷却后加入5×Reaction Buffer 4.0μL、10mM dNTP Mix 2uL、 RibolockTM Rnase inhibitor1μL、RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcniptase1μL；依 次 置 于PCR 仪 上42 ℃，60min、70 ℃，5min，得到cDNA,-80℃保存。取出cDNA，稀释10 倍，由上下游引物各1uL，cDNA1uL，RNase Free water 2uL 构成反应体系，其反应条件依次为95℃，5min、95℃，2s、60℃，10s，循环40 次，按2-ΔΔCt公式计算。

1.2.8 数据处理

采用GraphPadPrism8.0.1 软件绘制莠去津对精子顶体反应率影响数据的柱状图，若P＜0.05 则具有统计学意义；采用SPASS 23.0 统计软件分析实时定量PCR 结果，该结果为计量资料，以±s 表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，若P＜0.05 则具有统计学意义。

2 结果

2.1 通过查询CTD 数据库，并合并重复靶点，得到的莠去津作用于人类的靶点信息共有3010 个。

2.2 通过查询Genecards 数据库得到与人类精子顶体反应相关的靶点共有34 个，分析GO 生物学过程和KEGG 代谢通路，可知这些靶点除了与顶体反应相关外，还涉到精子获能、精卵识别与融合等过程。结果见表1，通路信息见图1。

2.3 将两个数据库所收集到的靶点信息取交集，可以得到莠去津作用于人类精子顶体反应的靶点为4 个（DLD、PLCD4、SYT8、TRIM36），这些靶点可为莠去津对人类精子顶体反应毒性作用的关键。其中莠去津作用于DLD、PLCD4 和TRIM36 为抑制作用，SYT8 为促进作用。收集到的靶点信息见表2。

2.4 在莠去津处理期间，各组小鼠均能正常饮食饮水，未出现小鼠死亡的现象。

2.5 与空白对照组相比，其他三组的精子顶体反应率明显低于空白对照组，且具有统计学意义(P＜0.05)；低、中、高剂量莠去津组相互比较发现，中剂量莠去津组精子顶体反应率最低，且与另外两组相比有统计学意义(P＜0.05)，符合相关文献提到的莠去津倒“U”形毒性效应。其结果见图2。

2.6 DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 的上下游引物序列均由上海伯豪生物技术有限公司合成，其结果如 下：DLD 上游为GAGCTGGAGTCGTGTGTACC，下游为 GAACCTATCACTGTCACGTCAG；PLCD4上游为 ATTCAAGACCTACTAGCCACTGA，下游为 CTCCACCAGATAGCGCAACAA；SYT8 上游为GGCCCAGTCTCATCCCAG A， 下游为GATGGCGATAAAGAGGGTCCA；TRIM 36 上游为 CGTTCAATGATGTGGCGTCAG， 下游为GGGTCAGTGAATTACGCTTCC。与空白对照组相比，其他三组的DLD、PLCD4、TRIM36 的mRNA 表达量明显降低，SYT8 的mRNA 表达量明显升高，且均具有统计学意义(P＜0.05)；低、中、高剂量莠去津组相互比较发现，中剂量莠去津组DLD、PLCD4 和TRIM36 的mRNA 表达量最低，SYT8 的mRNA 表达量最高，且与另外两组相比有统计学意义(P＜0.05)，符合倒“U”形毒性效应。其结果见表3。

图1 人类精子顶体反应相关靶点GO 生物学过程和KEGG 代谢通路

表1 人类精子顶体反应相关靶点信息

续表1

表2 莠去津作用于人类精子顶体反应靶点信息

表3 莠去津对小鼠DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 的mRNA 表达量的影响

图2 莠去津对小鼠精子顶体反应率的影响

3 讨论

生物的有性生殖过程涉及到精卵识别与结合的过程，在发生该过程前，精子需要发生顶体反应，以期获得足够的能量。在发生顶体反应前，精子需要通过获能的步骤达到顶体反应发生的必要条件，但主要发生在哺乳动物中，近期有研究认为非哺乳动物发生顶体反应无需精子获能[12]。本课题组主要研究的实验材料为中华绒螯蟹，不属于哺乳类动物，可推测精子获能不是中华绒螯蟹发生顶体反应的必要条件，在今后研究中华绒螯蟹顶体反应时不受精子是否获能影响。目前关于莠去津影响精子顶体反应的研究缺乏，本研究主要通过网络毒理学来发现莠去津如何影响顶体反应进程，并发现其作用靶点，并通过动物实验进行验证。

通过网络毒理学方法发现莠去津作用于精子顶体反应为以下4 个靶点：二氢硫辛酰胺脱氢酶(Dihydrolipoamide Dehydrogenase,DLD)、 磷 脂 酶Cδ4(Phospholipase C Delta 4,PLCD4)、突触受体8(Synaptotagmin 8,SYT8) 和三方基序包含蛋白36(Tripartite Motif Containing 36,TRIM36)，其中莠去津能抑制DLD、PLCD4 和TRIM36 基因表达，促进SYT8 基因表达。通路分析结果显示，这些靶点涉及的通路为顶体反应，表明这些靶点主要作用于顶体反应本身，对于精子获能、精卵识别等相关过程影响较小。

DLD 是形成丙酮酸脱氢酶体系的一种前体物质，可参与三羧酸循环过程。Sharmila 等[13]研究表明DLD 可与二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase,E2)的结合域作用，可为E2 的脂酰结构域可移动到该复合物中，形成重要的多酶体系。目前，有些研究报道称DLD 表达缺失可导致血浆瓜氨酸升高[14]、急性肝衰竭复发[15]等表现，说明DLD 靶点与多种病理过程相关。目前文献中关于DLD 与顶体反应的关系报道较少，Vivek 等[16]以仓鼠为研究对象，发现DLD、活性氧（ROS）、cAMP 和Ca2+在仓鼠精子的顶体反应必不可少，抑制DLD 可减少活性氧产生和cAMP 水平，并进一步导致顶体反应功能减退。

PLCD4 可参与细胞周期的调节作用。该物质由Liu[17]首次报道，为诱导细胞周期进入S 期的新物质，其定位与细胞核上。Marianna 等[18]以人间充质干细胞为研究对象，发现将PLCD4 基因敲除可增加G1 期细胞和减少间期及G2/M 期细胞比例，并且PLCD4 基因未敲除的干细胞其衰老细胞比例较高，表明该靶点可促进间充质干细胞增殖与衰老过程。PLCD4 在精子顶体反应发生过程中，也是一种不可或缺的成分。Fukami 等[19]研究了多种磷脂酶C 亚型在哺乳动物生殖细胞中的表达情况，发现PLCD4 在表达上处于优先地位，在透明带诱导的顶体反应中必不可少。

SYT8 为莠去津作用的4 个靶点中唯一一个促进其表达的靶点，属于膜转运蛋白大家族，在神经细胞、神经内分泌细胞和内分泌细胞中均有表达，但靶点不作为Ca2+传感器，具有无Ca2+ 敏感的可溶性[20]。SYT8 作为一种突触受体，可参与SNARE 蛋白介导的膜泡运输过程和胞吐作用。SNARE蛋白即可溶性的N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein attachment protein receptor)为一大类膜蛋白家族，主要通过形成SNARE 蛋白复合体，在膜融合和物质运输中有重要作用。在人类精子顶体反应中，SNARE 蛋白起着不可或缺的作用[21]。通过以上研究可推测莠去津作用于SYT8 靶点可间接通过SNARE 蛋白影响精子的顶体反应过程。

TRIM36 为三方基序包含蛋白成员之一，该类蛋白家族与肿瘤关系较密切，目前已有多篇关于两者关系的报道，如TRIM25 可促进结直肠癌进展[22]、TRIM29 与胃癌的关系[23]等。Man 等[24]报道称TRIM36 基因高表达能够提高胃癌放疗患者的总体生存率，表明该靶点为放疗治疗胃癌的重要靶点，可能为胃癌放疗敏感性的潜在靶点。目前研究TRIM36 与精子顶体反应的关系无专门的文献报告，仅有Hering 等[25]通过全基因组关联分析研究公牛的精子运动过程，发现TRIM36与精子运动有关，故研究TRIM36 与精子顶体反应的关系具有较大意义。

综上所述，运用网络毒理学的方法发现莠去津可通过DLD、PLCD4、SYT8 和TRIM36 这4 个靶点对精子顶体反应过程产生影响，其中莠去津对DLD、PLCD4 和TRIM36 起抑制作用，对SYT8 起促进作用。通过GO 生物学过程和KEGG代谢通路分析，可以发现上述靶点作用的生物学过程为顶体反应，进一步验证了网络毒理学方法具有一定的可靠性。通过动物实验也表明，莠去津可降低顶体反应率，对精子的顶体反应有抑制作用，并且可使DLD、PLCD4 和TRIM36 的mRNA 表达量降低，SYT8 的mRNA 表达量升高，且中剂量莠去津组尤为明显，符合文献中所提高的倒“U”形毒性效应。本研究仅以人类精子顶体反应过程的相关信息，并辅以小鼠的动物实验加以验证，对于中华绒螯蟹等非哺乳类动物是否准确有待进一步实验研究。