苦参素对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞线粒体保护作用的研究

杨 超

线粒体是细胞有氧呼吸和能量转化的主要场所，主要由双层生物膜和嵴构成。缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)导致线粒体电子传递链受阻，致使活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量产生与过剩而引发氧化应激损伤，是各类缺血性心血管疾病共同的病理通路[1,2]。因此，保护线粒体对改善缺血性心血管疾病具有重要意义。苦参素(oxymatrine，OMT)又名氧化苦参碱，是中药苦参的主要活性成分，化学结构属于喹诺西啶类生物碱，具有良好的抗氧化活性[3]。目前临床上主要用于慢性乙型病毒性肝炎及肿瘤放化疗引起的白细胞减少症的治疗，近年来研究发现OMT对缺血性脑损伤后神经元线粒体具有保护作用[4]。本研究将通过建立体外H/R损伤乳鼠心肌细胞模型，探究OMT对H/R所致乳鼠心肌细胞线粒体损伤的保护作用及其可能的机制。

材料与方法

1.实验动物：SPF级SD大鼠乳鼠(<24h)，购自河北省实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(冀)2018-004。

2.药物与试剂：OMT(纯度≥98%)购自南京泽朗医药科技有限公司(批号：20190331)；DMEM培养基、胰酶购自美国Gibco公司；胎牛血清、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国Invitrogen 公司；二甲基亚砜(DMSO)购自国药集团化学试剂有限公司；NADH脱氢酶(ND)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、细胞色素氧化酶(CCO)、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和ATP检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；膜电位(△ψm)、膜通透性转换孔(MPTP)开放度检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒购自北京博奥森生物科技有限公司。

3.乳鼠心肌细胞分离与体外培养：参照李雪丽等[5]报道的方法，无菌操作台取乳鼠心脏心室组织，剪碎后加浓度0.625g/L胰酶和浓度0.05g/L的Ⅱ型胶原酶后恒温37℃消化，细胞悬液过200目筛，1500r/min离心10min取沉淀，以DMEM培养液(含10%胎牛血清)重悬后，经37℃、5%CO2壁立1h，收集未贴壁细胞并调整细胞浓度为6×105个/毫升，接种于35mm培养皿，置于37℃、5%CO2、100%湿度细胞培养箱中72h后，细胞呈同步搏动，用于实验。

4.乳鼠心肌细胞分组、给药与H/R损伤细胞模型制备：取对数生长期乳鼠心肌细胞，消化、重悬后调整细胞浓度为6×105个/毫升，设正常组、H/R组和OMT低、中、高剂量(20、40、80μg/ml)组，每组设10皿；造模前30min给药干预[6]。除正常组外，其余各组弃培养液并用无糖DMEM冲洗3遍，2毫升/皿加入无糖DMEM培养基(预充95%N2和5%CO2混合气15min)，置缺氧盒(通入95%N2和5%CO2混合气，流速1L/min)，15min后将缺氧盒置细胞培养箱2.5h为缺氧过程，然后取出培养皿弃上清液，2毫升/皿加入含糖DMEM培养基，置37℃、5%CO2、100%湿度细胞培养箱培养，即复氧。复氧2h后行各指标检测。

5.线粒体提取：复氧2h后，取各组细胞，经0.25%胰酶消化后，4℃、650×g离心力离心5min收集细胞，加入4℃预冷裂解液于冰上裂解30min后，4℃、650×g离心力离心20min取上清液，然后4℃、7700×g离心20min取沉淀，即为线粒体，通过Lowry法检测蛋白浓度。

6.线粒体生化指标检测含量检测：取1mg蛋白量线粒体，参照试剂盒操作说明进行处理后，采用比色法，通过紫外-可见分光光度计检测线粒体ND、SDH、CCO活性和ATP含量。参照试剂盒操作说明进行处理后，通过紫外-可见分光光度计检测线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力；通过原子化学发光法检测游离Ca2+浓度。参照试剂盒操作说明进行处理后，遵照△ψm和MPTP开放度检测试剂盒说明，通过荧光酶标仪检测△ψm水平(激发波长485nm，发射波长590nm)和MPTP开放度(激发波长540nm，发射波长580nm)。

7.线粒体超微结构观察：复氧2h后，取各组细胞，经0.25%胰酶消化、无血清DMEM培养基洗涤3次后离心取细胞，置2.5%戊二醛固定2h、1%四氧化锇固定15min后梯度乙醇脱水、丙酮冲洗、环氧树脂包埋后行60nm超薄切片，醋酸钠染色、柠檬酸铅染色并晾干后，通过透射电子显微镜(TEM)观察线粒体超微结构。

8.线粒体MDA含量和SOD、CAT活力检测：经4℃、超声波破碎线粒体后，遵照试剂盒操作说明，采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量，黄嘌呤氧化法、钼酸铵法分别检测SOD、CAT活力。

结 果

1.OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体呼吸酶活性和ATP含量的影响：与正常对照组比较，H/R组乳鼠心肌细胞线粒体ND、SDH、CCO活性和ATP含量均显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与H/R组比较，OMT中、高剂量组ND、SDH、CCO活性和ATP含量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表1。

表1 OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体呼吸酶活性和ATP含量的影响

2.OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力和Ca2+浓度的影响：与正常对照组比较，H/R组乳鼠心肌细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力显著降低，游离Ca2+浓度显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与H/R组比较，OMT中、高剂量组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力显著升高且游离Ca2+浓度显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力和游离Ca2+浓度的影响

3.OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体△ψm和MPTP开放度的影响：与正常对照组比较，H/R组乳鼠心肌细胞线粒体△ψm显著降低、MPTP开放度显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与H/R组比较，OMT中、高剂量组△ψm显著升高且MPTP开放度显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表3。

表3 OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体△ψm和MPTP开放度的影响

4.OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体超微结构的影响：TEM下可见，正常对照组乳鼠心肌细胞线粒体形态和线粒体膜、线粒体嵴等均未见异常；H/R组可见线粒体数量减少、膜肿胀破裂、膜磷脂层破坏、线粒体嵴溶解断裂等超微结构病变；与H/R组比较，OMT处理组线粒体膜、嵴超微结构病变明显改善，其中OMT高剂量组线粒体膜、嵴结构较为完整，优于其他组，详见图1。

图1 OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体超微结构的影响(TEM，×10000)A.正常对照组；B.H/R组；C.OMT低剂量组；D.OMT中剂量组；E.OMT高剂量组

5.OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体MDA含量和SOD、CAT活力的影响：与正常对照组比较，H/R组乳鼠心肌细胞线粒体MDA含量显著升高，SOD、CAT活力显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与H/R组比较，OMT中、高剂量组MDA含量显著降低，SOD、CAT活力显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4。

表4 OMT对H/R损伤乳鼠心肌细胞线粒体MDA含量和SOD、CAT活力的影响

讨 论

随着高血压、高血脂、高血糖等基础疾病患病人群的增加，心肌梗死发生率呈逐年上升趋势，及时疏通血管、恢复血氧供应是临床抢救心肌梗死患者的关键，但恢复氧供后ROS大量释放导致的氧化应激反应，是引发二次损伤并严重影响预后的重要因素[7]。线粒体是心肌细胞最重要的细胞器，缺氧/复氧导致其电子传递链受阻是ROS生成的主要原因，并且ROS将攻击破坏线粒体膜和嵴结构，导致线粒体内细胞色素C释放并诱导细胞凋亡与自噬，从而加重病情[8]。因此保护线粒体对改善缺血性心血管疾病预后至关重要。

有氧呼吸是实现能量转换、产生ATP并为机体供给能量的主要途径，而线粒体是实现该过程的场所。有氧呼吸过程依赖于线粒体内呼吸酶(ND、SDH、CCO)的催化作用。生理状态下，体内ROS生成与代谢清除维持动态平衡，但缺氧/复氧将病理性刺激ROS大量释放致使抗氧化酶(SOD、CAT)被过度消耗，不能及时代谢清除的ROS将攻击破坏核酸、蛋白质等大分子，攻击生物膜不饱和脂肪酸生成具有生物毒性的MDA[9，10]。正常的线粒体△ψm水平对维持线粒体功能至关重要，Alizadeh等[11]研究发现△ψm降低将直接影响ATP合成。MPTP开放度病理性升高将破坏离子平衡，导致ROS生成、△ψm下降、细胞色素C释放，加重线粒体损伤[12]。

本研究通过分离并体外培养乳鼠心肌细胞，制备H/R损伤心肌细胞模型，发现模型细胞线粒体呈现数量减少、膜肿胀破裂、膜磷脂层破坏、线粒体嵴溶解断裂等超微结构病变，该结果与陈克芳等[13]研究报道一致；造模前30min给予OMT进行干预，能够明显提高线粒体ND、SDH、CCO活性和ATP含量，降低MDA含量并提高SOD、CAT活力，明显改善线粒体超微结构病变，提高线粒体△ψm并降低MPTP开放度，提示OMT对H/R所致乳鼠心肌细胞线粒体结构和功能损伤具有保护作用，可能与抑制氧化应激和维持线粒体膜稳定性有关。

线粒体具有储存Ca2+并维持细胞内Ca2+动态平衡的作用，线粒体的吸收和释放依赖Na+-Ca2+交换和Ca2+-ATP酶。ATP酶活力具有ATP依赖性，当线粒体结构和功能受损导致ATP合成受阻时将直接导致ATP酶活力降低。Ca2+-ATP酶活力降低将导致Ca2+泵出功能障碍，而Na+-K+-ATP酶活力降低将引发Na+-Ca2+交换使Ca2+大量进入线粒体，从而引发线粒体Ca2+超载[14]。过量的Ca2+能够破坏线粒体氧化磷酸化过程使ATP合成受阻，进一步抑制ATP酶活性，从而形成“ATP合成受阻-Ca2+超载”的恶性循环，加重心肌组织损伤[15]。本研究发现，造模前30min给予OMT进行干预，能够明显提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力并降低游离Ca2+浓度，提示抑制Ca2+超载可能是OMT保护H/R所致乳鼠心肌细胞线粒体损伤的重要机制之一。

综上所述，OMT对H/R所致乳鼠心肌细胞线粒体结构和功能损伤具有一定的保护作用，作用机制可能与抑制线粒体Ca2+超载、抑制氧化应激和维持膜稳定性有关。