穿心莲内酯对人胶质瘤细胞U87-MG的生长抑制及凋亡诱导作用的研究

黄桔，李晓文，蒋艳平，龙文清，周越菡

(1. 桂林医学院药学院，广西 桂林 541199；2. 桂林医学院临桂临床医学院，广西 桂林 541199)

胶质瘤(Glioma)是最常见的起源于中枢神经系统(CNS)的原发性恶性肿瘤，占颅内肿瘤的40%[1]。作为最严重的恶性星形细胞瘤，胶质瘤细胞无限增殖，并侵袭邻近的大脑结构且易转移[2]。目前，临床上治疗胶质瘤主要以替莫唑胺为基础化疗药物，结合手术切除和放疗[3-5]。然而，即使多种治疗手段联合应用，疗效依然欠佳，胶质瘤患者的预后仍然很差，并具有较高的复发率[6]。因此，开发治疗效果好且高效的抗胶质瘤药物具有极其重要的意义。

穿心莲内酯(andrographolide，AND)是源于爵床科植物穿心莲(Andrographispaniculata)的一种二萜内酯化合物。临床上被用作抗炎和抗感染药物[7-8]。近年来，许多研究显示AND可抑制多种肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡[9]。目前AND对治疗胶质瘤的研究非常有限，且AND对胶质瘤的作用鲜有报道。

本研究主要以人源胶质瘤细胞株U87-MG为实验对象，观察AND对胶质瘤U87-MG细胞体外生长的作用，探讨AND对线粒体膜电位及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的影响，并观察AND对JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响，探讨AND对胶质瘤U87-MG细胞凋亡调控作用的可能机制，以期为民族医药在胶质瘤的临床应用中提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 细胞株 人胶质瘤细胞U87-MG购自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 药物与试剂 AND(纯度98%，货号365645)购自Sigma-Aldrich公司；DMEM培养基(货号C1199-5500BT)、0.25% 胰酶(货号25200-072)均购自Gibco公司；胎牛血清(货号S711-001S)、BSA(货号U614-002)均购自Lonsera公司；青霉素-链霉素溶液(货号SV30010)购自Hyclone公司；RIPA裂解液(货号78501)购自Thermo公司；BCA试剂盒(货号ZJ101)、双色预染蛋白标准品(货号WJ102)、PAGE凝胶快速制备试剂盒(货号PG113、PG112)、10×电泳缓冲液(货号PS105)、10×转膜缓冲液(货号PS101)、10×TBS/T(货号PS103)、ECL超敏化学发光试剂盒(货号SQ201)均购自上海雅酶生物科技有限公司；Hoechst 33342染色液(货号C1022)、JC-1染色试剂盒(货号C2006)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(货号AS006)、抗体β-actin(货号AF0003)购自碧云天公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(货号SA00001-1)购自武汉三鹰公司；MTT(货号298-93-1)、二甲基亚砜(DMSO，货号D8371)、脱脂奶粉(货号D8340)、5×蛋白上样缓冲液(含DTT)(货号P1040)均购自索莱宝公司；抗体Bax(货号ab32503)、Bcl-2(货号ab182858)、JNK2(货号ab32101)、p-JNK2(货号ab108596)、STAT3(货号ab68153)、p-STAT3(货号ab76315)均购自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人胶质瘤细胞U87-MG培养于含1% 100 U/ml青霉素/链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃ 5%CO2培养箱中培养。

1.3.2 MTT实验 按照每孔2×104个细胞的密度在96孔板中接种U87-MG细胞，每孔100 μl细胞悬液，每组设置3个重复孔，用终浓度分别为0 μM、V、3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM的AND分别作用12 h、24 h、48 h，其中V组为溶剂对照组，加入最高药物浓度组所对应的DMSO。药物作用到达相应的时间后，每孔避光加入10 μl MTT(5 mg/ml)，置于37℃ 5%CO2饱和湿度的培养箱孵育4 h后，弃掉上清液，每孔加入100 μl DMSO摇床15 min，于490 nm处检测吸光度值(A值)。U87-MG细胞生长率(%)=(加药组平均A值/对照组平均A值)×100%。参照文献[10]，应用SPSS 18.0软件计算IC50。

1.3.3 JC-1染色实验 在6孔板中以5×104个细胞/孔的密度培养细胞，加入含AND的培养液，终浓度依次为0 μM、5 μM、10 μM、20 μM，同时设定阳性对照组(含CCCP 10 μM)作用24 h，弃上清，PBS洗1次，每孔加入1 ml 4%多聚甲醇固定20 min；每孔加入2 ml JC-1工作液，37℃孵育20 min；吸除上清液，每孔1 ml JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次，最后每孔加入2 ml 细胞培养液，于LSM710型激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。

1.3.4 Hoechst 33342染色实验 在6孔板中以5×104个细胞/孔的密度培养细胞制作细胞爬片。经0 μM、5 μM、10 μM、20 μM AND作用24 h后，弃掉原来的培养液，用PBS洗2遍，每孔加入1 μl Hoechst 33342染色液(5 mg/ml)和1 ml PBS，避光37℃孵育15 min。弃培养液，用PBS洗2遍，取出细胞爬片，置于载玻片上，加入抗荧光淬灭剂后，于IX73型荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.3.5 Western blot 检测Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达 收集每组细胞，预冷的PBS洗2次，加入裂解液，冰上裂解30 min，每10 min涡旋1次。4℃ 12000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量后，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋后沸水中变性10 min，将蛋白置于-80℃中保存。取30 μg蛋白在SDS-PAGE中分离后，电转到PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂牛奶或5% BSA室温封闭2 h，TBST洗1次，孵育Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin抗体，放在4℃过夜。TBST洗3次，每次10 min。孵育相应的Ⅱ抗。TBST洗3次，每次10 min。在膜上加入ECL化学发光液在化学发光成像系统中显影。用ImageJ软件进行各蛋白条带的灰度检测。

2 结果

2.1 MTT法检测AND对U87-MG细胞活力的影响 用3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM浓度的AND分别处理U87-MG细胞12 h、24 h、48 h后，观察U87-MG细胞活力。与对照组相比，随着药物浓度的增加和时间的延长，细胞活力显著降低(P<0.05)。作用12 h、24 h、48 h AND对U87-MG细胞的IC50分别为42.60 μM、13.20 μM、3.68 μM。见图1。

注：与对照组相比，*P<0.05，***P<0.001。图1 AND对U87-MG细胞活力的影响

2.2 Hoechst 33342染色观察AND对U87-MG细胞凋亡的影响 正常细胞核内DNA分布相对均匀，核无固缩，故在视野中呈现体积较大的浅染核形态，而凋亡的细胞细胞核呈碎块状致密浓染和半月形凝聚。结果显示，使用5 μM、10 μM、20 μM的AND处理后细胞核均出现典型的核固缩染象且发生凋亡核型改变的细胞随药物浓度的增加而增加。见图2。

图2 AND对U87-MG细胞凋亡的影响(×100)

2.3 JC-1染色观察AND对U87-MG细胞线粒体膜电位的影响 对照组的JC-1以多聚体形式存在并呈现红色荧光，提示线粒体膜电位正常。以线粒体电子传递链抑制剂CCCP作为阳性对照药处理U87-MG细胞24 h后，细胞线粒体膜电位明显降低，JC-1以单体形式存在，呈现绿色荧光。AND处理U87-MG细胞24 h后，随着AND浓度增大，U87-MG细胞的绿色荧光强度增加，显示细胞线粒体膜电位降低。见图3。

图3 AND对U87-MG细胞线粒体膜电位的影响(×400)

2.4 Western blot 检测AND对U87-MG细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影响 Western blot检测结果显示，与对照组相比，经5 μM、10 μM、20 μM AND处理后，U87-MG细胞内促凋亡蛋白Bax表达随药物浓度增加而增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达随药物浓度增加而减少。见图4。

注：与对照组相比，***P<0.001。图4 AND对U87-MG细胞Bax、Bcl-2蛋白的影响

2.5 Western blot 检测AND对U87-MG细胞JAK2/STAT3信号通路的影响 Western blot 检测结果显示，与对照组相比，5 μM、10 μM、20 μM AND下调U87-MG细胞内JAK2、STAT3和p-STAT3表达；10 μM、20 μM AND下调U87-MG细胞内p-JAK2表达。见图5。

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图5 AND对U87-MG细胞JAK2/STAT3信号通路的影响

3 讨论

AND是一种常见的天然二萜内酯化合物，是从广西特色中药爵床科植物穿心莲中提取的活性成分，具有来源广泛、价格低廉、毒副作用小等优点，因此，AND在抗肿瘤中的作用受到越来越多的关注。据文献报道，AND可通过抑制肿瘤细胞生长、诱导细胞周期阻滞，减少细胞浸润和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用[9，11-12]。并且作为天然药物的AND，其脂溶性高，能渗透血脑屏障[13]，对治疗胶质瘤有潜在的应用价值。Yang SL等[14]曾经报道过，AND可以抑制GBM8401和U251胶质瘤细胞的生长。根据世界卫生组织(WHO)制定的标准，可将胶质瘤分为Ⅰ级至Ⅳ级，其中Ⅰ、Ⅱ为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别恶性胶质瘤[15]。本研究以Ⅳ级恶性胶质瘤U87-MG细胞株为研究对象，采用不同浓度和不同时间的AND分别作用于细胞后，发现AND可浓度和时间依赖性地抑制胶质瘤U87-MG细胞的生长。

细胞凋亡是严格受到细胞信号调控的自主性消亡的过程[16]。细胞凋亡在维持机体正常稳定中起着重要作用，机体可以通过细胞凋亡来清除损伤、突变和衰老的细胞，以维持自身的生理平衡。细胞凋亡伴随于多细胞生物的生长、发育、存活以及死亡等过程[17-18]。有研究表明[19]，AND可诱导p53蛋白活化增加，进而激活下游caspase 7-PARP，诱导C6胶质瘤细胞凋亡。我们采用Hoechst染色实验观察AND作用后细胞核型的变化，结果显示药物处理后，细胞核固缩，细胞凋亡数增加，证明AND诱导U87-MG细胞凋亡。

线粒体是细胞能量代谢的中心，在凋亡过程中起到枢纽的作用。在凋亡发生过程中，线粒体膜的通透性会改变，从而导致线粒体膜电位(MMP)发生巨大变化[20]。我们采用MMP指示剂JC-1对药物处理后的U87-MG细胞进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察MMP的变化情况。JC-1是一种常见的应用于检测MMP的理想荧光探针。多聚体形式存在的JC-1，呈现红色荧光，提示MMP正常；当细胞发生凋亡时，MMP去极化，JC-1从线粒体内被释放到胞浆内，胞浆内以单体形式存在的JC-1，发出绿色荧光。我们发现应用5 μM AND处理之后，U87-MG细胞MMP降低，浓度为20 μM时，对MMP的影响几乎接近10 μM CCCP，表明AND能通过降低MMP诱导U87-MG细胞凋亡；在此基础上，我们进一步研究AND对凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的调控作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，它们在调控细胞凋亡方面发挥重要的作用[21]。Western blot结果显示，U87-MG细胞经AND处理24 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2下调且促凋亡蛋白Bax上调，为进一步研究AND抗胶质瘤的详细机制提供了重要依据。

JAK2/STAT3信号通路与细胞的增殖、分化、凋亡有关[22-24]。JAK是一类非跨膜型的酪氨酸激酶[25]。当配体和受体结合后JAK被活化，使其发生自身磷酸化，活化的JAK可以作为激酶，磷酸化下游靶蛋白的酪氨酸残基，进行信号传递。当转录因子STAT被招募，并且被活化的JAK磷酸化修饰后，就形成了活化的状态，活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与相关靶基因结合，调控下游基因的转录[26]。有研究表明，AND在多种癌细胞中通过调节JAK2/STAT3信号通路调控癌细胞的增殖和凋亡[13，27]。Zhou J等[28]发现AND在HCT116细胞中有效抑制IL-6引起STAT3的磷酸化并在mRNA水平下调p-JAK1和p-JAK2，从而增加HCT116细胞对阿霉素化疗的敏感性。目前，已有多个研究表明，在胶质瘤治疗过程中抑制JAK2/STAT3信号通路，有效抑制胶质瘤细胞的生长，促进胶质瘤细胞凋亡[29-30]。本实验中，AND下调JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平，表明AND在胶质瘤U87-MG细胞中抑制JAK2/STAT3信号通路的激活，进而调控U87-MG细胞的生长及凋亡。

综上所述，本实验研究显示，AND对人胶质瘤细胞U87-MG具有抑制细胞生长和诱导凋亡的作用，且与JAK2/STAT3信号通路的失活相关。本研究为胶质瘤的治疗提供了初步的理论基础及实验依据，并为民族医药应用于临床治疗胶质瘤提供新策略。