UPLC-MS/MS法同时测定黄芪-甘草药对8个有效成分

王晶萍，董微微，赫志强，董林争，赵丽珠*

(1. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076； 2.鹤岗市检验检测中心，黑龙江 鹤岗 154100； 3.谱尼测试有限公司，哈尔滨 150028)

黄芪为豆科植物蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var.mongholicus(Bge.)Hsiao]或膜荚黄芪[A.membranaceus(Fisch. ) Bge. ]的干燥根，具有补气升阳、生津养血、固表止汗、托毒生肌等功效，是我国最具代表的补气药物之一[1].黄芪配伍甘草(GlycyrrhizaeRadix，GR)，二者相须为用，可以大大提高二者间的协同作用[2].黄芪-甘草药对始载于《太平惠民和剂局方》，能补肺肾二气、调和脾胃表里脏腑、化津布液以滋益肾水、又能外固卫外而强腠理[3].现代药理研究亦证明：黄芪-甘草可治疗诸虚不足[4]、脾肺气虚[5]、慢性乙型肝炎肝硬化[6]，酒精性肝纤维化及糖尿病[7]等病.

黄芪中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草中甘草酸、甘草苷为主要的药理活性成分[8-9]，同时上述4种成分也是药典中收录的黄芪或甘草药材质量控制指标成分.黄芪甲苷具有抗炎、降压、抗癌、治疗代谢性疾病等作用[10-12]，是黄芪-甘草药对中最重要的活性成分之一.毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有抗肿瘤、抗氧化活性、抗炎作用、保护血管内皮细胞，还可通过抑制Rho/ROCK通路、上调AKT通路，改善细胞凋亡和抑制炎症，从而保护内皮细胞[13-14].甘草酸具有抗炎、抗溃疡、抗过敏、抗氧化、抗疫调节、抗病毒、抗癌、保肝和稳定细胞膜等作用[15-17]；甘草苷具有抗抑郁、神经保护、对肝脏毒性的保护、对心脏系统的作用[18-19].

与大量的药理活性相比，对黄芪-甘草药对中主要活性成分的研究未见文献报道.丁淑芹等[20]灌胃给予昆明小鼠黄芪-甘草药对水提液，发现其对环磷酰胺诱导的损伤具有保护作用，并可显著抑制增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率.此外，王迪等[21]的黄芪-甘草药对、黄芪、甘草均可提高小鼠细胞免疫功能，且黄芪-甘草药对组的活性强于黄芪组和甘草组.另有研究发现，黄芪-甘草药对可使大鼠胆汁淤积性肝硬化程度显著减轻[7].基于此，本研究采用UPLC-MS/MS法同时测定黄芪-甘草药对中8种主要成分含量，以期为中药黄芪-甘草药对的临床应用提供科学依据.

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC I-Class系统、Xevo TQS系统(美国Waters公司)；旋转蒸发仪(德国IKA公司)；AG-245电子分析天平 (瑞士Mettler-Toledo公司)；FW177中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；标准检验筛(60目，孔径0.30 mm，绍兴上虞华丰五金仪器有限公司)；乙腈和甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，乙酸(色谱纯，德国Merck公司).

1.2 材料

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：U0520010)、甘草苷(批号：12400010)、芒柄花苷(批号：G2990010)、甘草素(批号：T4890010)、毛蕊异黄酮(批号：34410010)、黄芪甲苷(批号：T0920025)、芒柄花素(批号：Q4150010)、甘草酸(批号：3462)购于上海安谱有限公司.所有化合物经HPLC-DAD分析，纯度均大于98%.黄芪购于内蒙古、贵州、河南、山西、甘肃、黑龙江.甘草购于新疆、内蒙古、甘肃、山西、陕西、黑龙江.样品标本保留在哈尔滨商业大学药学院中心实验室.经哈尔滨商业大学大学曲中原教授鉴定分别为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根、豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎.

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

色谱采用Waters ACQUITYTMUPLC系统检测.色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(50 mm ×2.1 mm, 1.7 μm )柱; 柱温：30 ℃; 流动相：体积分数0. 1%乙酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱; 洗脱程序：0～1.0 min 20% B，1.0～7.0 min 20%～60% B，7.0～9.0 min 60%～90% B，9.0～9.1 min 90%～20% B，9.1～10.0 min 20% B; 流速：0. 3 mL·min-1；自动进样；样品室温度：20℃；进样量：2 μL.

质谱条件: 电喷雾离子源(ESI源)，多反应监测模式(MRM)检测，源温度和脱溶剂气温度分别为150 ℃和500 ℃，脱溶剂气为氮气，流速为1 000 L·h-1，碰撞气为氩气，毛细管电压为3.0 kV.8个分析物的定量离子、定性离子、保留时间、锥孔电压等信息见表1.

表1 8种分析物的定量离子、定性离子、保留时间、锥孔电压和碰撞能量

2.2 供试品溶液的制备

黄芪、甘草药材干燥24 h，打粉，过60目筛，按6∶1比例分别称取干燥的黄芪、甘草粉末共计10 g，置500 mL圆底烧瓶中，加水200 mL，浸泡12 h后，加热回流提取1 h，提取3次，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液，合并上清液并旋干.精密称取黄芪-甘草提取物10 mg，用适量10%甲醇-水溶解，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液[22].

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸适量置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.配成质量浓度分别为1.0 mg·mL-1的储备液，置于4 ℃冰箱中储存.

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

分别取对照品、供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进行分析，各化合物之间无干扰，方法专属性良好.

2.4.2 线性关系考察

精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸标准系列溶液，配制成相当于毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，甘草苷质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，芒柄花苷质量浓度为0.02、0.04、0.08、0.12和0.20 μg·mL-1，甘草素质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，毛蕊异黄酮质量浓度为0.02、0.04、0.08、0.12和0.20 μg·mL-1，黄芪甲苷质量浓度为0.06、0.12、0.18、0.24和0.30 μg·mL-1，芒柄花素质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg·mL-1，甘草酸质量浓度为1.00、2.00、5.00、10.0和20.0 μg·mL-1，按色谱条件进样分析.以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，绘制标准工作曲线.各指标成分在测定浓度范围内，线性关系良好，结果见表2.以特征离子对色谱峰的信噪比(S/N)≥3 确定检出限(LOD)，S/N≥10 确定定量限(LOQ)，结果见表2.

表2 8种分析物的回归方程、相关系数、线性范围、检出限、定量限

2.4.3 精密度

精密吸取同一份对照品溶液2 μL，按“2.1”项色谱条件连续测定6次，结果显示：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸RSD在0.08%～3.56%之间，表明仪器精密度良好.

2.4.4 重复性

以黄芪-甘草药对提取物进行重复性考察，按照上述供试品制备方法，平行制备黄芪-甘草样品6份，进样2μL，依法测定，记录峰面积，结果显示：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸RSD分别为0.92%、1.83%、1.69%、2.37%、1.31%、0.82%、2.49%、2.48%，表明方法重复性良好.

2.4.5 稳定性

取黄芪-甘草药对提取物供试品溶液，分别于室温下0、4、8、12、24、48 h，进样2 μL，依法测定，记录峰面积，结果显示：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸RSD在0.92%～2.49%之间，表明供试品溶液在48 h内稳定.

2.4.6 加样回收率

取批号为100602的黄芪-甘草药对样品6份，每份约0.10 g，精密加入8种对照品，按照上述供试品制备方法，平行制备黄芪-甘草样品6份，进样2 μL，依法测定，结果显示：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸平均加样回收率分别为99.59%、98.52%、98.10%、97.83%、96.63%、98.60%、98.44%、98.15%.

2.5 样品测定

精密称取黄芪-甘草药对，按“2.2”项下方法制备样品溶液，每个样本平行3份，按“2.1”项下色条件进行测定，色谱图见图1.

图1 黄芪-甘草中8种分析物的UPLC-MS/MS色谱图

2.6 结 果

6批黄芪-甘草药对药材，按“2.2”项下方法制备样品溶液，精密吸取2 μL进样 UPLC-MS/MS进行分析，测定结果见表3.

表3 黄芪-甘草药对中含8种成分的量(mg·g-1)

3 讨 论

本文考察了不同流动相系统，包括乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-10 mmol/mL乙酸铵水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液，结果表明，乙腈-0.1%乙酸水系统洗脱时，待测分析物灵敏度较高、色谱峰峰形、分离度、基线噪音均能达到较好的洗脱效果，故本实验最终采用乙腈-0.1%乙酸水溶液作为流动相系统.8种待测组分分别以质量浓度0.50mg/L和2.0 μL/min的流速直接用注射泵进行优化，标准溶液通过流动相注入离子源中，在正离子或负离子模式下得到准分子离子峰，再对准分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，使每种组分的准分子离子产生的特征碎片离子强度达到最大；标准溶液由 UPLC进样，再对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量等进行优化.选择两对离子对，其中干扰小、信噪比大的离子对作为定量离子对.设定合适的峰驻留时间(dwell time)确保色谱峰的采样点数在12～20点，从而得到较好的定量重复性，优化得到的质谱参数.

黄酮和皂苷类化合物是黄芪-甘草药对的主要活性成分，因皂苷类化合物无紫外吸收或有微弱的紫外吸收，故用DAD检测器无法同时测定黄酮和皂苷类化合物.所以本文首次建立UPLC-MS/MS法同时测定黄芪-甘草药对中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷、芒柄花素、甘草酸8种有效成分含量的方法，多指标控制黄芪和甘草药材提供参考.