高效液相色谱法同时测定乳扇中的6 种食品添加剂

□ 李 涛 杨 伟 李 蓉 赵海云 刘泽弘 大理州食品检验检测院

乳扇是云南大理白族人民的一种传统民族食品，属于拉伸型干酪[1]，是将鲜牛乳加入煮沸的酸浆中经凝乳、热烫、拉伸等制成的食品[2]，酸浆是将未煮过的牛奶置于太阳下使其自然发酵变酸而得，也可以利用酸木瓜或梅子加水煮沸、静置而得[3]。乳扇富含多种矿物元素和维生素，其中蛋白质含量达到30.4%，脂肪含量达到50%，铁含量较其他乳制品高，可以达到5.5 mg/100 g[4]。乳糖不耐症患者和糖尿病患者也可食用乳扇[5]，但由于乳扇中的蛋白质以大分子酪蛋白为主，且脂肪含量过高，不易被婴幼儿消化吸收，故不宜作为婴幼儿食品[6]。目前乳扇大部分是以家庭作坊的形式生产，制作乳扇的原料乳大多来自家庭散养的奶牛，产品质量难免会参差不齐。经查阅文献，目前对乳扇的研究主要集中于加工工艺[2,3,7]、营养成分[1,4,6]和金属元素含量检测[8—10]方面，对乳扇中食品添加剂检测的研究报道较少。因此，本工作拟建立一种高效液相色谱法同时测定乳扇中的安赛蜜、柠檬黄、苯甲酸、糖精钠、山梨酸和日落黄，旨在为乳扇的质量控制提供方法参考。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

UItimate 3000 高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB—C18色谱柱（安捷伦科技有限公司）；JY5002 电子天平（上海舜宇恒平仪器有限公司）；TDL—40B 离心机（上海安亭科学仪器厂）；AS1709325 超声波清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；VORTEX2 涡旋混匀器（DAIHAN Scientific Co.）；UPH—IV—20T 超纯水机（云南优普科技有限公司）；THB—B 数显水浴恒温振荡器（常州市国立试验设备研究所）。

安赛蜜、柠檬黄、苯甲酸、糖精钠、山梨酸和日落黄标准溶液（浓度均为1 000 μg/mL，均购自坛墨质检—标准物质中心）。

乙腈（色谱纯，德国Merck 公司）；海砂（含量≥99.8%，天津市光复精细化工研究所）；石油醚、乙酸锌、亚铁氰化钾、无水乙醇、氨水、冰乙酸（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

乳扇样品购自大理当地特产店，切碎后置于4 ℃冰箱中冷藏备用。

李老鬼认定，他侄儿落到这一步，全是付玉害的。这天，他决定给付玉联系一下，打了几个号，终于有一个是通的。他说，我是李叔和的叔，有个大人物想见你。另外，我有一包东西要送你。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别吸取1.0 mL 浓度为1 000 μg/mL的安赛蜜、柠檬黄、苯甲酸、糖精钠、山梨酸和日落黄标准溶液于10 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制成浓度为100 μg/mL的混合标准储备液。

1.2.2 样品前处理方法

称取2 g（精确到0.01 g）样品置于研钵中，加入10 g海砂和2 mL超纯水，研磨混匀，吹冷风使试样干燥，加入50 mL 石油醚，混匀，静置片刻，弃去石油醚，重复处理3 次，吹干后转入50 mL 聚丙烯离心管中，加入10 mL无水乙醇+氨水+水（体积比，7+2+1）溶液，超声提取10 min 后依次加入2.5 mL 亚铁氰化钾（106 g/L）溶液和2.5 mL 乙酸锌（219 g/L）溶液，涡旋混匀1 min，4 000 r/min 离心5 min，上清液转移至100 mL 烧杯中，于残渣中加入10 mL 无水乙醇+氨水+水（体积比，7+2+1）溶液，涡旋混匀1 min后超声提取5 min，4 000 r/min 离心5 min 后合并上清液至同一100 mL烧杯中，重复操作3 ～5 次，直至残渣中无色素残留。将上清液用冰乙酸调节pH 至7.0，于80 ℃水浴蒸发至近干后，用超纯水定容至10 mL，过0.22 μm 聚醚砜微孔滤膜，上机检测。

1.2.3 高效液相色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB—C18色谱柱（4.6 mm×250 mm），5—Micron；流动相：甲醇—0.02 mol/L乙酸铵，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；紫外检测波长：230 nm。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 样品的处理

乳扇中含有大量的蛋白质和脂肪，故本试验未直接加提取液提取，而是先在样品中加入适量海砂和水，充分研磨使其均匀分散开，加入石油醚除去脂肪后再加提取液提取，由于蛋白质是一种胶体，亚铁氰化钾和乙酸锌反应生成的氰亚铁酸锌沉淀能够挟走或吸附干扰物质，且这两种高浓度的盐离子水化能力很强，能够夺取蛋白质分子的水化层，对蛋白质的溶解度有显著影响，能有效沉淀样品中的蛋白质[11]，故本试验选择106 g/L 亚铁氰化钾溶液和219 g/L 乙酸锌溶液来去除样品中的蛋白质。

2.2 样品的提取

亚铁氰化钾和乙酸锌反应生成的氰亚铁酸锌沉淀会吸附柠檬黄和日落黄，用超纯水提取很难将其洗脱下来。安赛蜜、柠檬黄和日落黄是水溶性化合物，易溶于水和极性溶液，苯甲酸、山梨酸和糖精钠在碱性条件下以盐的形式存在，可溶于强极性溶剂。查阅相关文献[12—15]，通常用氨化乙醇和氨化甲醇来洗脱合成着色剂，考虑到高浓度的乙醇可使蛋白质脱水，促进蛋白质的凝聚，同时乙醇可起到破坏沉淀胶体减少干扰的作用[16]，本试验选择无水乙醇+氨 水+ 水（体 积 比，7+2+1）作 为 提取剂。

为防止堵塞、污染色谱柱和管路系统，在上机检测前应使用微孔滤膜过滤。试验发现，尼龙滤膜对柠檬黄和日落黄有较强的吸附作用，而聚醚砜滤膜几乎不吸附这6 种组分，因此，在上机前先用0.22 μm 聚醚砜微孔滤膜过滤。6 种食品添加剂的色谱图见图1。

图1 样品加标（25 mg/kg）色谱图

2.3 线性和检出限

分别吸取0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 、2.00 mL 与5.00 mL浓度为100 μg/mL 的混合标准储备液于10 mL 容量瓶中，用超纯水定容至刻度，配制成浓度为0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL和50.0 μg/mL 的标准工作溶液，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6 种组分混合标准溶液的色谱图见图2。在样品中添加一定量的混合标准使用液，按2.1 中的方法处理后上高效液相色谱仪检测，称样量按2 g 计，以3 倍信噪比（S/N）所对应的浓度计算检出限；以10 倍信噪比（S/N）对应的浓度计算定量限，6 种组分的线性方程、线性范围、相关系数、检出限与定量限列于表2。从表2 可以看出，各组分在0.0 ～50 μg/mL 浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数大于0.999 9，检出限为0.15 ～1.40 mg/kg，定量限为0.5 ～4.7 mg/kg，满足待测组分的检测要求。

图2 混合标准溶液（5 μg/mL）色谱图

表2 线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.4 加标回收率

准确称取2 g（精确到0.01 g）样品于研钵中，分别加入0.1、0.2、0.50 mL 浓 度 为100 μg/mL 的 混 合标准储备液，混匀，分别制成6 种食品添加剂含量均为5、10、25 mg/kg 3 个浓度水平的加标样品，每个浓度水平做6 个平行测定，按照2.1 项下方法处理样品后测量，测量结果列于表3。从表3 中可以看出，样品的加标回收率在85.5%～112.6%，相对标准偏差为0.14%～3.55%。表明方法的准确度良好。

3 结论

本研究建立了一种高效液相色谱法同时测定乳扇中安赛蜜、柠檬黄、苯甲酸、糖精钠、山梨酸和日落黄的方法。在最佳条件下，样品的加标回 收 率 为85.5% ～112.6%， 相 对标准偏差为0.14%～3.55%，检出限在0.15 ～1.40 mg/kg，定量限在0.5 ～4.7 mg/kg。本方法线性关系良好，回收率高，精密度好，能够为乳扇的质量控制提供一定的数据支持和方法参考。

表3 样品的加标回收率（n=6）