猪肺炎支原体二乙烯亚胺灭活条件的研究

张智明，张凤强，柴 华，刘洪斌

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniaeof Swine，MPS）是由猪肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mhp）感染引起的一种慢性肺炎，又称猪喘气病、猪地方流行性肺炎，临床表现为咳嗽、气喘、腹式呼吸及生长速度缓慢，并会导致感染猪出栏时间延长、猪只出栏体重不达标等。猪肺炎支原体在单纯感染时，死亡率较低，但猪肺炎支原体能够侵害猪的免疫系统，引起免疫抑制和继发感染，使死亡率大大增加，常给猪养殖企业造成重大的经济损失。有研究表明，MPS 的总体感染率可达到40%～50%，在屠宰场出现该病典型病变的猪可达到30%～80%[1]。在我国，20 世纪50—60 年代曾暴发过猪支原体肺炎的大规模流行，由此造成了猪只生产性能的降低，并由于额外治疗费用的支出增加了养殖户的养殖成本[2-3]。接种疫苗是防控猪支原体肺炎的主要手段。在我国，研制和使用的国产疫苗主要是活疫苗，但接种方法比较烦琐，而关于灭活疫苗的研究较少。本研究主要探讨了新型的灭活剂二乙烯亚胺（BEI）对猪肺炎支原体C 株的灭活条件，从而为制备猪肺炎支原体灭活疫苗提供参考。

1 材 料

1.1 菌株

猪肺炎支原体C株，活菌含量109.34CCU·mL-1，由哈药集团生物疫苗有限公司分离并保管。

1.2 主要试剂

PPLO肉汤培养基（测定活菌含量时加入终浓度为1%的酚红），由哈药集团生物疫苗有限公司GMP 车间制备、检验和提供；猪血清，Gibco 公司产品；酵母提取物，OXOID公司产品；葡萄糖（分析纯），国药集团公司产品；半胱氨酸氢氯化物、2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA），美国Sigma 公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

2 方 法

2.1 猪肺炎支原体抗原的制备

将猪肺炎支原体C 株按照5%的接种量接种于2 000 mL 的锥形瓶中，在37 ℃、40 r·min-1的条件下培养60 h 左右，当OD650nm值达到0.07 时停止培养，收获抗原液，于2～8 ℃保存，备用。

2.2 活菌含量测定

取猪肺炎支原体菌液混匀后，吸取0.2 mL 加入到含有1.8 mL PPLO 肉汤培养基的DB 小管内，充分混匀后稀释为10-1。按照上述方法依次进行10-2～10-10稀释，其中10-1～10-44个稀释度作1 个重复，10-5～10-10作6 个重复。将各个稀释度置37 ℃、90 r·min-1条件下培养15 d，每天观察各稀释度的变色情况，第16天判定结果。

2.3 BEI灭活猪肺炎支原体

将2 mol·L-1的BEA和2 mol·L-1的NaOH溶液等体积混合，置37 ℃水浴，每隔10～15 min 摇匀1 次，1 h 后即环化产生BEI，终浓度为1 mol·L-1，将BEI均匀地加入到上述收获的菌液中，至终浓度分别为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mmol·L-1，37 ℃灭活，分别于灭活后8、12、16、20、24 h取样。在取样的同时加入终浓度与相应BEI 浓度相等的硫代硫酸钠溶液，混合均匀，并在37 ℃条件下搅拌24 h，然后迅速降温至2～8 ℃，备用。

2.4 抗原液中BEI被中和后残留的验证

对硫代硫酸钠终止灭活后的抗原液取样，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入1/10 体积的5%AgNO3（w/v）溶液，观察沉淀颜色。

2.5 猪肺炎支原体的灭活检验

将灭活的菌液用PPLO 肉汤培养基分别进行5倍、10倍、20倍的稀释，并设阴、阳性对照，在37 ℃下、80 r·min-1摇床培养16～17 d，观察有无颜色变化。阳性对照应出现明显颜色变化；阴性对照液体培养基应无颜色变化；灭活菌液无颜色变化判为灭活完全。

3 结果与分析

3.1 抗原液中BEI被中和后的残留情况

抗原液离心后的上清液加入5% AgNO3溶液后，有黑色沉淀产生，说明硫代硫酸钠过量，从而说明BEI已被完全中和。

3.2 灭活情况检验

灭活试验结果见表1。

表1 37 ℃水浴条件下不同浓度BEI灭活结果

由表1试验结果可知，1.0 mmol·L-1的BEI作用24 h不能完全灭活猪肺炎支原体C株，2.0 mmol·L-1的BEI 作用24 h 可完全灭活支原体，4.0 mmol·L-1浓度的BEI 作用20 h 即可完全灭活支原体，6.0 mmol·L-1浓度的BEI 作用16 h 即可完全灭活支原体，8.0 mmol·L-1浓度的BEI作用8 h即可完全灭活支原体。综合BEI的用量和灭活时间考虑，选择BEI 浓度为4.0 mmol·L-1、37 ℃水浴灭活，时间为24 h作为该疫苗的最佳灭活条件。

4 结 论

通过对猪肺炎支原体C 株菌液灭活工艺中BEI的终浓度和灭活时间进行比较，确定用终浓度4.0 mmol·L-1的BEI 在37 ℃灭活24 h 作为猪肺炎支原体C株的灭活条件。灭活后使用等量的硫代硫酸钠中和残留BEI，可确保疫苗灭活彻底且无残留。