高效液相色谱法测定饲料添加剂25-羟基维生素D3 含量的方法研究

赵小阳，虞哲高，张 进，何 雷

（1.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，北京 100081；2.帝斯曼（中国）有限公司，上海 201203）

维生素D3是一种具有多种生理功能的类固醇类激素，天然形式的维生素D3不具有生物活性，其活性形式为1α,25-二羟基维生素D3。维生素D3首先在肝脏经25-羟基酶作用下，脱氢生成25-羟基维生素D3，然后在肾脏中经1α羟化酶羟化生成1α,25-二羟基维生素D3[1]。25-羟基维生素D3是维生素D3的第一个代谢产物，也是维生素D3在血液循环中的主要活性形式，其生物效价是维生素D3的3～5 倍[2]。动物通过采食饲料中的25-羟基维生素D3，吸收后可在血液中获得25-羟基维生素D3，绕开肝脏的羟化反应，能更有效地转化成最终生物活性代谢物[3]。在饲料中添加一定量的25-羟基维生素D3，可调节动物体内的钙磷平衡，维持骨骼健康，改善免疫功能，调节能量代谢，并在提高畜禽生产性能、改善畜产品品质方面也有一定作用[2]。欧盟于2005 年批准25-羟基维生素D3作为饲料添加剂用于禽，于2009 年批准了25-羟基维生素D3作为饲料添加剂用于猪。研究表明，在仔猪的耐受性试验中，仔猪饲粮中添加推荐量5～10 倍的25-羟基维生素D3不影响其生理指标[4]。25-羟基维生素D3是一种安全系数较高的饲料添加剂[2]，我国农业部（现为农业农村部，下同）第2045 号公告中将其列入《饲料添加剂品种目录（2013）》，准许用于猪和家禽饲料中。2017 年农业部的2625 号文规定了25-羟基维生素D3在配合饲料和全混合日粮中的最高限量。近年来，25-羟基维生素D3在畜禽养殖业中得到了广泛应用，除进口25-羟基维生素D3饲料添加剂外，我国目前已有几家企业生产该产品，但我国目前尚未有饲料添加剂25-羟基维生素D3产品的行业标准。本文采用高效液相色谱法测定饲料添加剂25-羟基维生素D3含量，以期为饲料添加剂25-羟基维生素D3的含量测定提供操作简单、准确可靠的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备 电子分析天平：感量0.1 mg 和0.01 mg，德国Sartorius 公司；数显控温水浴锅：精度0.1℃，超声波水浴清洗器，功率280 W，德国IKA 公司；离心机：12 000 r/min，美国Thermo 公司；高效液相色谱仪：配有紫外可调波长检测器或二极管矩阵检测器，美国Agilent 1200。

1.2 试剂和溶液 甲醇：色谱纯，购于Fisher Scientific公司；甲醇：国产分析纯试剂；水：符合《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682-2008）标准，一级。80%甲醇溶液：400 mL 甲醇，用水稀释至500 mL，混匀。25-羟基维生素D3一水化合物对照品（CAS：63283-36-3，纯度≥98.0%），购于Dr.Ehrenstorfer 公司。

25-羟基维生素D3标准贮备溶液：称取25-羟基维生素D3一水化合物对照品25 mg（精确至0.01 mg）于25 mL 的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。溶液保存于-20℃冰箱。

25-羟基维生素D3标准工作溶液：准确移取25-羟基维生素D3标准贮备液5.0 mL 于50 mL 的棕色容量瓶中，用80%甲醇溶液定容。临用时现配。

1.3 方法

1.3.1 25-羟基维生素D3含量的测定

1.3.1.1 试样溶液的制备 称取1 g试样（精确至0.000 1 g），置于100 mL 的棕色容量瓶中。在容量瓶中加入20 mL水，摇匀后在超声波水浴中超声处理20 min，用甲醇定容。摇匀后取适量于离心机上，以10 000 r/min 转速离心5 min，上清液用0.2 μm 滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析。

1.3.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18柱，长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm；流动相：甲醇+水=80+20；流速：1 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：35℃；进样量：20 μL。

1.3.1.3 转换系数F 的测定 在一定温度下，少量的25-羟基维生素D3会转化为预25-羟基维生素D3，这一性质与维生素D3的性质有类似之处。在生产、储存和检测过程中，饲料添加剂25-羟基维生素D3产品中会有部分的预25-羟基维生素D3由25-羟基维生素D3转化而来，正如在饲料添加剂维生素D3的产品中，会有部分的预维生素D3存在一样。在维生素D3产品中，现行的国家标准[5-6]以维生素D3和预维生素D3的含量之和作为产品中维生素D3的总量。在饲料添加剂25-羟基维生素D3产品中，25-羟基维生素D3总量以25-羟基维生素D3和预25-羟基维生素D3的含量之和来表示。由于得不到商品化的预25-羟基维生素D3的标准物质，预25-羟基维生素D3的含量通过转换系数F 来计算，计算公式：

具体测定方法及字母代表的含义如下：将1 mL 的25-羟基维生素D3标准工作溶液装入进样小瓶，将20 μL的标准工作溶液注入高效液相色谱仪，得到25-羟基维生素D3的色谱峰。测定的25-羟基维生素D3的峰面积记为A。如果在色谱图中有预25-羟基维生素D3色谱峰，预25-羟基维生素D3的峰面积记为Apre。

取5 mL 的25-羟基维生素D3标准工作溶液倒入具有螺旋瓶盖的10 mL 螺口试管中，旋紧瓶盖，置于50℃恒温水浴中，放置3 h 后取出，冷却至室温后将试管内的溶液取1 mL 装入进样小瓶，将20 μL 标准工作溶液注入高效液相色谱仪，得到25-羟基维生素D3的色谱峰和预25-羟基维生素D3色谱峰（图1）。25-羟基维生素D3的峰面积记为A*，预25-羟基维生素D3的峰面积记为Apre*。

1.3.1.4 分析结果的表述 试样中25-羟基维生素D3的含量计算公式如下：

图1 25-羟基维生素D3 标准工作溶液经50℃加热后色谱图

式中，X1为试样中25-羟基维生素D3的含量，单位为%；F 为25-羟基维生素D3与预25-羟基维生素D3峰面积的转换系数；Aspre为样品溶液中预25-羟基维生素D3峰面积；As 为样品溶液中25-羟基维生素D3峰面积；Apre为25-羟基维生素D3标准工作溶液中预25-羟基维生素D3峰面积；A 为25-羟基维生素D3标准工作溶液中25-羟基维生素D3峰面积；C 为25-羟基维生素D3标准工作溶液的浓度，单位为μg/mL；m 为样品的质量，单位为g。

1.4 方法学验证

1.4.1 方法的检测限和定量限 分析方法的检测限LOD 和定量限LOQ 由信噪比（S/N）计算。LOD 定义为S/N=3时对应的待分析物浓度，LOQ 定义为S/N=10 时对应的待分析物浓度。将25-羟基维生素D3标准溶液用80%甲醇溶液稀释，当25-羟基维生素D3的浓度为0.18 μg/mL，软件计算得到的S/N=2.7。按样品的取样量及稀释体积计算，方法的检测限为0.018 mg/g。当25-羟基维生素D3的浓度为0.52 μg/mL，软件计算得到的S/N=9.7。按样品的取样量及稀释体积计算，方法的定量限为0.052 mg/g。

1.4.2 方法的线性范围 取25-羟基维生素D3标准贮备液用80% 甲醇溶液稀释，配制系列标准工作液，最终浓度分别为3.014、6.028、9.042、18.084、60.280、90.470、150.700 μg/mL。系列标准工作液进样20 μL，按所述色谱条件测定。结果表明25-羟基维生 素D3在3.0～150.7 μg/mL 浓度范 围内峰面积（Y）与浓度（X）线性相关性良好。回归线性方程为Y=48.8246X+0.7358，线性相关系数r=1.000。

1.4.3 精密度试验 按1.3.1 试样溶液的制备方法，称取标示量为1.25% 的饲料添加剂25-羟基维生素D3的试样6 份，按色谱条件检测样品的含量，计算其相对标准偏差RSD%。25-羟基维生素D3试样的6 次测试的含量均值为1.28%（1.26%～1.29%），相对标准偏差（0.91%）小于1%，表明该方法有较好的精密度。

1.4.4 加标回收率试验 精密称取约0.4 g 同一批次的饲料添加剂25-羟基维生素D3样品9 份，置于100 mL 的棕色容量瓶中。该批次样品的本底值为1.28%。在容量瓶加入20 mL 水，摇匀后在超声波水浴中超声处理20 min。将试样分为3 组，每组3 份。于每组中分别精确加入25-羟基维生素D3的标准贮备溶液（浓度为1.056 mg/mL）2.5、5.0、10.0 mL，在容量瓶中加入50 mL 甲醇，在超声波水浴中超声处理20 min 后用甲醇定容至刻度，摇匀后取适量于离心机上，以10 000 r/min 转速离心5 min，上清液用0.2 μm 滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析。从表1 中可以看出，在不同添加水平下，回收率范围为96.97%～101.23%，平均回收率为98.19%，相对标准偏差为1.9%。

表1 加标回收率的实验结果

1.4.5 稳定性试验 将配制好的样品溶液置于棕色的进样小瓶中，每隔1 h 进样一次，连续进样12 h。试验结果显示，12 h 内峰面积变化不大，峰面积的相对标准偏差为0.9%，表明12 h 内，25-羟基维生素D3在避光条件下稳定。将样品溶液置于透明的进样小瓶内，在光照条件下放置12 h 后测定，发现25-羟基维生素D3的含量有一定程度的下降，表明25-羟基维生素D3在光照条件下不稳定，因此在操作中应注意样品的避光。

2 结果与分析

2.1 转换系数F 如表2 所示，温度的高低不影响转换系数F 值的大小。将标准溶液在90℃水浴中回流45 min和标准溶液在50℃水浴中放置3 h 得到的转换系数F 值分别为2.18 和2.21。由于将标准溶液在50℃水浴中放置的操作更简便，因此在分析方法中采用了标准溶液在50℃水浴中放置3 h 的方法来测定转换系数F 值。

表2 转换系数F 的测定

2.2 实际样品的测定 7 个批次饲料添加剂25-羟基维生素D3产品来源于几家生产商，这7 批次样品按照1.3.1试样溶液的制备方法操作，得到样品溶液中25-羟基维生素D3的浓度不同，但均在测定的线性范围之内，结果见表3。原因可能在于饲料添加剂25-羟基维生素D3标示量没有统一规定，不同生产商会提供不同规格的产品。

表3 实际样品的测定结果 %

饲料添加剂25-羟基维生素D3是以化学合成制备法制得的25-羟基维生素D3结晶为原料，配以辅料经喷雾、包被、干燥制成的粉状产品。在样品的色谱图中，除25-羟基维生素D3和预25-羟基维生素D3的色谱峰外，还有其他的色谱峰存在。由于不同生产商所用的原辅料有差异，从7 批次样品的色谱图上看，其他峰的种类有差异，如图2 其他峰种类较少，图3 其他峰种类较多。

为获得准确的测试结果，应关注25-羟基维生素D3和预25-羟基维生素D3与其他色谱峰的分离度情况。从图2 和图3 可以看出，按照1.3.2 色谱条件推荐的Agilent Eclipse XDB C18 柱，能得到分离度较好的色谱图。为考察方法的耐用性，尝试了其他品牌或者类别的C18 色谱柱进行分离。试验发现，用Waters Symmetry C18 柱也能得到分离度好的色谱图。而对于Agilent ZORBAX SB-AQ C18 柱或Waters Atlantic C18柱，在分析样品时会产生分离度差的问题。

3 结 论

图2 饲料添加剂25-羟基维生素D3 样品7 色谱图

图3 饲料添加剂25-羟基维生素D3 样品5 色谱图

本文建立了用高效液相色谱法测定饲料添加剂25-羟基维生素D3含量的方法，样品前处理的方法简单，有较广的线性范围，能满足市场上不同含量产品的测定；精密度和加标回收率表明该方法能满足分析要求。本方法具有较高的实际应用价值。