麻黄含量测定方法研究

肖丹丹，孙莹莹，徐自信，刘芳馨，林喆，李勇

（长春中医药大学药学院，吉林 长春）

0 引言

麻黄（Herba Ephedrae）为多基原传统中药（中麻黄、草麻黄及木贼麻黄），始载于《神农本草经》，列为中品。其性温、味辛、微苦；归肺、膀胱经；具有发汗散寒[1]、宣肺平喘、利水消肿及治疗腹膜炎等多种功效，仅2015版《药典》收载含有麻黄的成方制剂就多达56个。现代药理学研究表明其主要药效物质基础为麻黄碱与伪麻黄碱，2005年药典即对所含麻黄碱做了明确的限量规定，而2010版和现行2015版药典又增加了伪麻黄碱的含量测定，可见准确、稳定、可行的含测方法尤为重要。

文献研究表明，历版药典[2-4]用于麻黄含测的高效液相色谱法（HPLC）在不断完善，即从反相C18键合硅胶柱（2005版，流动相：ACN-0.1% H3PO3，9:87）变为极性乙醚连接苯基键合硅胶柱（2010版，流动相：MeOH-含0.04%三乙胺与0.02%二正丁胺的H3PO3溶液，1.5:98.5；2015版，流动相：MeOH-含0.04%三乙胺与0.02%二正丁胺的0.092%H3PO3溶液，1.5:98.5），其目的是能够同时准确检测上述两种立体异构体（麻黄碱与伪麻黄碱）。但由于色谱条件变化后的要求越来越高，致使应用并不普遍，如2015版药典所载以麻黄为含测指标的22个中成药中，仅有2味制剂选用极性乙醚柱及相应色谱条件，其他均为C18色谱柱；另据文献检索显示，自2010版药典改用极性乙醚色谱柱至今的10年间，中国知网、维普、清华同方、万方及超星数据库中报导使用极性乙醚柱的文献仅8篇[5-12]，其中含有色谱图的仅4篇。

本文采用常规普遍使用的C18色谱柱，针对其主要影响因素的流动相进行了初步的优化研究，同时结合相关横向课题（校企横向课题，吉林省利华制药有限公司），以优化后的色谱条件对中麻黄饮片进行了实际的含量测定研究，结果表明该方法准确、重现性好且易于操作，为麻黄含测方法的进一步完善提供了实验依据。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（SPD-10A VPLC-10AT VPAT-330，日本岛津）；XS205型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；ST-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；超声波清洗器（型号：KQ200B，昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂

盐酸麻黄碱对照品（供含量测定用，批号171241-201809）、盐酸伪麻黄碱对照品（供含量测定用，批号171237-201510）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、磷酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.3 样品收集

购于吉林大药房，经长春中医药大学林喆教授鉴定为中麻黄（Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Mey.）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液分别制成每l mL含40 μg的溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液制备

精密称取麻黄药材粉末（过3号筛）1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液100 mL，密塞，超声处理（功率为250 W，频率为50 Hz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.2 色谱条件优化

在采用极性乙醚色谱柱且有色谱图的文献中可见（仅4篇），无论采用2010版药典流动相（日本岛津公司报道见图1A）还是2015版流动相（见图1B）均未获得最佳分离色谱，其中前者盐酸麻黄碱有严重的拖尾现象；而后者盐酸麻黄碱峰对称性不佳，直接影响了含量测定的准确性。

笔者采用2005年版药典方法对盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱对照品及麻黄药材分别进行了重复试验，对照品及药材中两个成分均未达到基线分离（见图1C）；另外依据最新文献报道色谱条件，即 C18 色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、乙腈-0.2%磷酸溶液（4:96）为流动相、检测波长为210 nm、柱温25 ℃及流速0.8 mL/min进行了重复实验，结果显示盐酸伪麻黄碱与甲基麻黄碱并未完全分离（见图1D）。

经对所有色谱条件反复多次的考察，发现流速、柱温及检测波长并非主要影响因素，因此对流动相进行了系列梯度变化摸索研究，最终确定流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（1.5:98.5），两峰均得到完全分离（见图2A），两峰理论塔板数和拖尾因子均符合现行版药典要求。故确定色谱最佳条件：上述流动相、C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、检测波长为 210 nm，柱温 25 ℃，流速 0.8 mL/min。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验

取上述对照品溶液和供试品溶液适量，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图2。盐酸麻黄碱标准品液相色谱图中苦参碱保留时间为57 min，盐酸伪麻黄碱保留时间69 min，理论板数均＞3000。

2.3.2 线性关系考察

分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品2.19 mg和2.18 mg，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置 10 mL 容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为测试溶液，分别精密量取各溶液10 µL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对相应浓度进行线性回归处理。结果表明：盐酸麻黄碱在10.90～180.00 μg/mL线性关系良好，回归方程为Y=9701.7X+847，r2=0.9994；盐酸伪麻黄碱在 10.95～80.00 μg/mL 线性关系良好，回归方程为Y=9766.5X-750.7，r2=0.9995。

图1 药典(2010、2015和2005版)和参考文献方法HPLC色谱

2.3.3 精密度实验

取“2.1.1”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。测得RSD=1.79%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性实验

取麻黄样品约1 g，按照“2.1.2”下供试品溶液制备方法制备5份，按“2.2”项下色谱条件。进行含量测定，计算RSD值为1.66%，表明样品处理方法重复性良好。

2.3.5 稳定性实验

按“2.1.1”项下对照品的制备方法，制备新对照溶液，按“2.1”项下色谱条件连续注入液相色谱分别于 0、2、4、6、8、10、12 h的标准品并测定峰面积，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱峰RSD值分别为1.68%和1.45%，表明溶液在12 h内稳定。

2.3.6 加样回收率实验

取的麻黄样品1.0 g共18份，分两大组，两大组分三小组分别精密加入盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱标准品相当于样品浓度的80%、100%、120%。按照制备“2.1.2”项下供试品溶液的提取方法提取，另取“2.1.1”项下对照品溶液进样测定做对照，并计算盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱低中高3个浓度的加样回收率，结果见表1。

图2 麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱HPLC色谱图

表1 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱加样回收率试验结果(n=9)

表2 麻黄含量测定(n=3)

结果表明，盐酸麻黄碱在低中高3个浓度中的加样回收率均在98.7%～101.8%，平均回收率100.39%，RSD值为1.18%，盐酸伪麻黄碱在低中高3个浓度中的加样回收率均在98.4%～101.8%，平均回收率100.11%，RSD值为1.16%，表明本方法回收率良好。

2.4 含量测定

取麻黄样品，粉碎成粉末，过三号筛。精密称取1.0 g，各3份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。另取“2.1.1”项下对照品溶液作对照，按“2.2”项下色谱条件进行样品测定，计算麻黄供试品的中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱含量。所测样品的盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱含量均＞0.80%，结果符合药典规定结果，见表2。

3 讨论

3.1 色谱柱

建议继续使用常规普遍应用的C18反相色谱柱。虽然极性乙醚色谱柱具有更好的苯基选择性和改善生物碱峰型的特点，但流动相精度过高，可操作性不强，一致性较难控制，在麻黄含量测定的实际应用中麻黄碱与伪麻黄碱的分离并不稳定，没有达到理想的分离效果。此外，过高的成本和过强专属性也限制了应用。相反C18反相色谱柱其理论塔板数可以达到10000以上，同时对称性（拖尾因子）和分离度均符合药典要求。

3.2 波长与柱温

分别取盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱，经紫外光谱扫描，结果显示两种对照品均为末端吸收。参考2015年版《药典》将210 nm作为测定波长。实验考察了不同温度对色谱分离的影响（20 °C、25 °C、30 °C 和 35 °C），结果表明温度变化不会造成两生物碱色谱峰的变化，因此不作温度限制。

3.3 含量

2005版药典规定盐酸麻黄碱含量不得低于1.0%，而2010版将色谱柱换成极性乙醚柱后，增加了盐酸伪麻黄碱的含量测定，并规定两个成分的总含量不得低于0.8%，即单一成分的含量限度高于两个成分总含量限度，其中缘由仍然值得进一步研究商榷。

3.4 保留时间

采用该色谱方法虽然准确、稳定且简便易行，但仍然存在保留时间过长的不足，有待进一步完善。