姜黄素通过下调microRNA-125b 保护人视网膜色素上皮细胞免受高糖诱导的细胞损伤

苏军华焦永伟魏宏莲

(1.河北医科大学第二医院检验科,石家庄 050000; 2.河北省中医院骨科,石家庄 050000)

糖尿病是一种慢性代谢性疾病,全球约有4.15亿糖尿病患者,而亚洲患病人数约超过2.3 亿,且呈逐年上升趋势,严重危害患者身心健康及生活质量[1]。 糖尿病长期进展可损害眼、肾、神经、血管等多种组织并引起严重并发症[2]。 人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是视网膜细胞重要营养及代谢组织,糖尿病患者长期处于高糖环境下,易使RPE 细胞因高糖刺激机体产生过多氧自由基造成氧化应激损伤,从而导致多种视网膜病变[3]。 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见眼部微血管并发症之一,是导致患者视力损伤甚至失明的重要原因[4-5]。 姜黄素是一种酚性色素,存在于姜黄、郁金、莪术等中药的根茎中,具有抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、降血糖[8]等多种药理活性,但关于其对DR 的影响鲜有报道。 miR-125b是miR-125 家族中一员,其异常表达与糖尿病[9]及其胰岛素抵抗[10]等密切相关,是糖尿病治疗的新型靶点分子。 因此通过高葡萄糖糖浓度建立高糖环境,拟探究姜黄素对高糖诱导人ARPE-19 细胞损伤的作用及miR-125b 表达的影响,以期揭示其作用机制,为临床应用提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

ARPE-19 细胞(目录号:CC-Y1051)购自美国ATCC 公司。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F-12 培养基(批号:12634010)、胎牛血清(FBS,批号:10099141)均购自美国Gibco 公司;PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit(批号:6210A)、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(批号:638314)均购自大连TaKaRa 生物技术有限公司;引物及 miR-125b 抑制物( inhibitor)/阴性对照(negative control,NC)由上海生工生物工程股份有限公司合成;SOD 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 试剂盒(批号:69 -21389)购自武汉默沙克生物科技有限公司;MTT 试剂盒(批号:C0009)、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(批号:C1062S)购自上海碧云天有限公司。 CO2培养箱购自美国 Thermo Fisher 公司;FACS-Calibur 流式细胞仪购自美国Becton Dikinson公司;MODEL550 型酶标仪、7500 RT-qPCR 仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与处理

常规复苏ARPE-19 细胞后于含体积分数10%FBS,1%青链霉素的DMEM/F-12 培养基中置于体积分数5% CO2、37℃培养箱中培养。 细胞传代用0.25%胰蛋白酶消化。 将对数期生长ARPE-19 细胞分为5 组:对照组(5 mmol/L 葡萄糖处理)、高糖组(30 mmol/L 葡萄糖处理)、高糖+姜黄素组(30 mmol/L 葡萄糖+80 μmol/L 姜黄素共处理)、高糖+inhibitor 组(30 mmol/L 葡萄糖 +miR-125b inhibitor转染共处理)、高糖+inhibitor-NC 组(30 mmol/L 葡萄糖+ miR-125b inhibitor-NC 转染共处理),每组6个重复,培养48 h 后收集细胞进行后续检测。 实验重复4 次。

1.3.2 MTT

采用MTT 试剂盒检测各组 ARPE-19 细胞活性,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。 细胞活性=(OD处理组/OD对照组)×100%。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI

每孔ARPE-19 细胞培养结束后添加500 μL 结合缓冲液重悬,加入5 μL Annexin V-FITC 混匀后,添加5 μL PI,避光轻振混匀,室温放置15 min。 同时设置对照(无Annexin V-FITC 和PI),放入流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并计算细胞凋亡率。

1.3.4 ROS 检测

各组细胞培养结束后分别用磷酸盐缓冲液洗涤,以终浓度为 10 μmol/L 2′-7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′-7′dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)避光37℃孵育2 h,荧光显微镜下观察各组ARPE-19细胞荧光强度,以荧光强度的强弱反映细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。

1.3.5 SOD 检测

收集各组细胞,破碎细胞后离心取上清液,采用ELISA 检测超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD)水平,具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.6 RT-qPCR

采用TRIzol 试剂提取各组细胞总RNA,纯度及浓度检测合格后反转录合成cDNA,采用实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)试剂盒进行miR-125b 扩增,miR-125b 上游引物序列:5′-TGTGATCCCTGAGACCCTAAACTTGTGA-3′,下游引 物 序 列: 5′-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3′。内参 U6 上游引物序列:5′-GCTTCGGCAGCACAT ATACTAAAAT-3′,下游引物序列:5′-CGCTTCACG AATTTGCGTGTCAT-3′。 反应体系:SYBR(2 ×)10 μL,ROX Dye II(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 0.8 μL,ddH2O 6.0 μL。 每个样品设置 3 个复孔。 反应条件:95℃ 30 s;95℃ 5 s,60℃ 34 s,40 个循环。 采用 2-ΔΔCT法分析其相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。 计量资料以平均数±标准差(±s)表示,多组间进行单因素方差分析(One-way ANOVA),进一步两两比较采用SNK-q检验。 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖环境下姜黄素增强ARPE-19 细胞活性

与正常ARPE-19 细胞比较,高糖诱导环境下ARPE-19 细胞活性显著降低(图1,P<0.01),而姜黄素和miR-125b inhibitor 可显著升高ARPE-19 细胞活性(P<0.01)。

2.2 高糖环境下姜黄素降低ARPE-19 细胞凋亡

与正常ARPE-19 细胞比较,高糖诱导环境下ARPE-19 细胞凋亡率显著增加(图2,P<0.01)。 姜黄素处理及miR-125b inhibitor 转染后,ARPE-19 细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。

2.3 高糖环境下姜黄素抑制miR-125b 表达

与正常ARPE-19 细胞比较,高糖诱导环境下ARPE-19 细胞中miR-125b 表达水平显著升高(图3,P< 0.01), 而姜黄素处理及转染 miR-125b inhibitor 可显著降低 ARPE-19 细胞中 miR-125b 表达水平(P<0.01)。

注:A:对照组;B:高糖组;C:高糖+姜黄素组;D:高糖+inhibitor-NC 组;E:高糖+inhibitor 组。 与对照组比较,∗∗P<0.01;与高糖组比较,&&P<0.01;与高糖+inhibitor-NC 组比较,##P<0.01。图1 高糖环境下姜黄素对ARPE-19 细胞活性的影响(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+ curcumin group.D, High glucose + inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose +inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 1 Effect of curcumin on cell viability of ARPE-19 cells in a high glucose environment

2.4 高糖环境下姜黄素抑制ROS 生成

与正常ARPE-19 细胞比较,高糖诱导环境下ARPE-19 细胞中ROS 生成水平显著增加(图4,P<0.01),而姜黄素处理及转染miR-125b inhibitor 可显著降低 ARPE-19 细胞中 ROS 生成水平(P<0.01)。

2.5 高糖环境下姜黄素促进SOD 表达

与正常ARPE-19 细胞比较,高糖诱导环境下ARPE-19 细胞中SOD 表达水平显著降低(图5,P<0.01),而姜黄素处理及转染miR-125b inhibitor 可显著增加 ARPE-19 细胞中 SOD 表达水平(P<0.01)。

3 讨论

目前用于治疗和预防糖尿病血管病变的药物有限,且存在一定副作用[11]。 现代研究认为,糖尿病的发生可能与环境因素、遗传因素及自身免疫功能等共同作用有关,提高机体抗氧化能力是治疗糖尿病及其血管并发症疾病的新方向[12]。 姜黄素是一种多酚类化合物,其结构中有2 个邻甲基化酚和1 个β-二酮功能基团,与多种生物活性密切相关,具有调节血脂代谢、抗炎和抗氧化等多种功能[13]。研究报道,姜黄素在改善糖尿病、肥胖及促进GLUT4 基因表达等方面具有一定治疗作用[14],还可减轻糖尿病大鼠海马的内质网应激、凋亡和胆碱能功能障碍[15],且可通过提高DR 大鼠视网膜抗氧化能力及抗凋亡能力,改善糖尿病引起的视网膜变薄、基底膜增厚及感光细胞膜盘紊乱等[16]。 本研究结果发现,与正常细胞相比,姜黄素处理后ARPE-19 细胞活性、SOD 表达水平显著增加,凋亡率、ROS生成水平显著降低,与刘俊平等[17]人研究结果一致,表明姜黄素处理可逆转高糖对ARPE-19 细胞的损伤作用,清除氧自由基,增强其抗氧化能力,促进ARPE-19 细胞存活,抑制其凋亡,但其具体作用机制尚不清楚。

注:A:对照组;B:高糖组;C:高糖+姜黄素组;D:高糖+inhibitor-NC 组;E:高糖+inhibitor 组。 与对照组比较,∗∗P<0.01;与高糖组比较,&&P<0.01;与高糖+inhibitor-NC 组比较,##P<0.01。图2 高糖环境下姜黄素对ARPE-19 细胞凋亡的影响(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P<0.01.Compared with the high glucose+inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 2 Effect of curcumin on cell apoptosis of ARPE-19 cells in a high glucose environment

注:A:对照组;B:高糖组;C:高糖+姜黄素组;D:高糖+inhibitor-NC 组; E: 高 糖 + inhibitor 组。 与 对 照 组 比 较,∗∗P<0.01;与高糖组比较,&&P<0.01;与高糖+inhibitor-NC 组比较,##P<0.01。图3 高糖环境下姜黄素对ARPE-19 细胞中miR-125b表达的影响(n=6)Note.A,Control group.B,High glucose group.C,High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose+inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 3 Effects of curcumin on the expression of miR-125b in ARPE-19 cells in a high glucose environment

注:A:对照组;B:高糖组;C:高糖+姜黄素组;D:高糖+inhibitor-NC 组;E:高糖+inhibitor 组。 与对照组比较,∗∗P<0.01;与高糖组比较,&&P<0.01;与高糖+inhibitor-NC组比较,##P<0.01。图4 高糖环境下姜黄素对ARPE-19 细胞中ROS生成的影响(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose +inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 4 Effects of curcumin on the expression of ROS content in ARPE-19 cells in a high glucose environment

注:A:对照组;B:高糖组;C:高糖+姜黄素组;D:高糖+inhibitor-NC 组;E:高糖+inhibitor 组。 与对照组比较,∗∗P<0.01;与高糖组比较,&&P<0.01;与高糖+inhibitor-NC 组比较,##P<0.01。图5 高糖环境下姜黄素对ARPE-19细胞中SOD 表达的影响(n=6)Note.A, Control group.B, High glucose group.C, High glucose+curcumin group.D, High glucose+inhibitor-NC group.E, High glucose+inhibitor group.Compared with the control group, ∗∗P<0.01.Compared with the high glucose group, &&P < 0.01.Compared with the high glucose +inhibitor-NC group, ##P<0.01.Figure 5 Effects of curcumin on the expression of SOD in ARPE-19 cells in a high glucose environment

miR-125 家族进化过程中高度保守,由 miR-125a、miR-125b-1、miR-125b-2 三个成员组成,其中miR-125b 是糖尿病治疗的新型靶点生物分子[18]。有研究显示,miR-125b 在2 型糖尿病患者外周血中显著上调[19],可通过靶向血管紧张素转化酶2(ACE2)介导高糖诱导的HK-2 肾小管上皮细胞ROS 的产生和凋亡,是预防糖尿病肾病的潜在治疗靶点[20]。 且有研究报道,下调miR-125b 可增加大鼠视杆双极细胞异常突起,增强内层神经元信息输入,改善变性视网膜功能[21]。 本研究结果发现,与正常ARPE-19 细胞比较,高糖诱导环境下ARPE-19细胞中miR-125b 表达水平显著升高,而姜黄素处理及转染miR-125b inhibitor 可显著降低ARPE-19 细胞中miR-125b 表达水平,与Gong 等[22]人研究报道下调miR-125b 可抑制DR 进展结果一致,提示姜黄素可能通过下调miR-125b 减轻ARPE-19 细胞氧化应激损伤,促进ARPE-19 细胞活性,抑制其凋亡。

综上所述,本研究初步揭示了姜黄素可通过下调miR-125b 降低 ARPE-19 细胞 ROS 生成及增加SOD 表达,提高其抗氧化能力,减轻ARPE-19 细胞受高糖诱导的细胞损伤,可能为姜黄素用于DR 治疗及研究提供新的治疗手段。 但关于姜黄素对miR-125b 下游靶向基因调控机制尚不明确,是本研究不足之处,有待进一步深入探究。