肝泡型包虫病特异microRNA的筛选及初步研究

任 宾，樊海宁，王海久，任 利

青海大学附属医院 肝胆胰外科，西宁 810001

肝泡型包虫病(alveolar echinococcosis, AE) 是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, Em) 幼虫寄生于人体而引起的一种疾病。该病原发于肝脏，呈侵入性、肿瘤样生长，有“虫癌”之称[1]。AE具有潜伏期长、感染初期无明显症状、后期易转移等特点[2]。

目前棘球蚴病的诊断主要依靠传统的诊断方法，如临床诊断、影像学诊断以及免疫学诊断。传统诊断方法存在一定的不足，且患者间差异较大[3]，而影像学与免疫学在检测灵敏性与特异性上存在欠缺[4]。分子生物学等技术的发展为棘球蚴病的诊断提供了更多的空间，也使包虫病患者在早期诊断上有了重大突破。

微小RNA(miRNA)是一类内源性的，长度约为22 nt的小分子非编码RNA，能够通过靶向剪切mRNA或者翻译抑制的方式在基因的转录后水平进行调控，进而影响多种生理和病理过程[5-6]。通过深入测序和miRNA微阵列技术，发现宿主细胞或组织中的miRNA在寄生虫感染过程中被调控，并在宿主对病原体的反应中发挥重要作用[7-8]。Jin等[9]研究发现，感染多房棘球绦虫会打乱小鼠肝脏中40%与miRNA合成相关的基因，例如ago1、ago4、tarbp2和xrn2等基因，由此通过深度测序分析发现,而在泡球蚴感染寄主的过程中，miRNA也起着至关重要的作用[10]，对其功能性的预测显示，其中一些miRNA参与了对寄生虫感染的免疫和炎症反应[11]。由此可见，加深miRNA对寄生虫侵染寄主过程中的调控这方面的研究，可针对特异miRNA调控的代谢途径开发治疗性药物；也可针对病原相关的miRNA进行检测，提高前期诊断的灵敏性和特异性[12]。循环miRNA是一类在血清、血浆等体液中稳定存在的分子，可感染蠕虫的人和动物的血液或体液中稳定地检测到[7,13-14]。循环miRNA已在各种肿瘤、心脏病、肝损伤等疾病中作为潜在生物标志物，成为早期诊断、分型和预后判断的重要指标[15-19]。循环miRNA在寄生虫感染中作为生物标志物也有相关的报道，循环sja-miRNA-223是日本血吸虫感染的潜在生物标志物[20]。

基于以上推测,肝泡型包虫可能会导致血浆中miRNA的改变。所以本实验通过高通量小分子RNA芯片检测发现,患者病灶区组织和血浆中的miRNA表达谱与正常组织差异明显，其中一些miRNA具有显著性差异可作为检测标志物的候选分子，再通过荧光定量实验验证这些潜在的miRNA检测标志物的候选分子是否存在差异性。探索血浆样本和组织样本的miRNA表达异质性，确定血浆循环miRNA作为一种新的生物标志物的可行性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2016年6月—2018年5月在本院确诊的AE患者，选取其中2例患者的病灶边缘组织、3例患者的临近病灶边缘的正常组织、3例患者的血浆样本进行microRNA芯片检测，另随机选取15例患者设为AE组进行验证。纳入同期于本院进行体检的健康者，选取其中3例健康体检者的血浆样本进行microRNA芯片检测，另随机选取15例设为健康组进行验证。AE诊断标准参照《肝两型包虫病诊断与治疗专家共识(2015版)》[21]。纳入标准：(1)血清学包虫病抗体IgG检验、超声检查、肝脏三期动态扫描、3.0T MRI动态增强检查完整者；(2)接受外科手术治疗，术后病理亦确诊为肝泡球蚴病。排除标准：(1)合并有慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎者；(2)既往有结核病史者；(3)合并其他病史并接受过肝脏手术治疗者。

1.2 研究方法

1.2.1 miRNA的提取 手术取下0.5～250 mg组织标本，在15 min内用液氮浸没迅速降温保存。使用EDTA抗凝采血管新鲜收集AE患者和健康体检者的全血标本，4 ℃ 1500 r/min离心10 min收集上层血浆标本。利用 mirVanaTM RNA Isolation Kit(Invitroge，AM1561)提取组织和血浆样品的总RNA，提取的RNA样本利用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific)定量并经Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)检测RNA完整性。

1.2.2 miRNA芯片检测组织miRNA表达水平 RNA质检合格后，参照Agilent Human miRNA Microarray (8*60K，Design ID: 070156)芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。首先，取100 ng total RNA起始，定容到2 μl，总RNA经过去磷酸化；样本在37 ℃ PCR仪上变性30 min，再进一步用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记。标记好的RNA纯化后和芯片杂交，洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。

1.2.3 miRNA数据分析 采用Feature Extraction 软件 (version10.7.1.1, Agilent Technologies)处理原始图像提取原始数据。接着利用Genespring软件(version 12.5; Agilent Technologies)进行quantile标准化和后续处理。对标准化后的数据进行过滤，用于比较的每组样本中至少有1组75%标记为Detected的探针留下进行后续分析。 利用t检验的P值和倍数变化值进行差异miRNA筛选，筛选的标准为:log2(差异倍数)绝对值>1.2、P<0.05。接着，利用3个数据库(Targetscan、microRNAorg、PITA)共同对差异miRNA进行靶基因预测，对靶基因进行GO和KEGG富集分析，以判定差异miRNA主要影响的生物学功能或者通路。最后，对差异miRNA进行非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异miRNA在不同样本间的表达模式，为后续研究miRNA的筛选做准备。

1.2.4 miRNA表达验证 利用实时PCR验证芯片检测结果，(1)选择在AE患者肝脏病灶边缘带组织差异显著性表达的hsa-miRNA-4644，hsa-miRNA-136-5p，hsa-miRNA-483-3p。(2)血浆RNA提取与反转录：提取200 μl血浆至干净的1.5 ml离心管中，加入1 ml QIAzol®Lysis Reagent，涡旋混匀，室温静置5 min，然后每管加入350 μl miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control (1.6×108拷贝/μl working solution)涡旋混匀，洗涤，从而收集总RNA溶液并进行反转录。应用ABI7500定量PCR仪运用SYBR Green实时PCR方法验证选择的差异表达miRNA，采用公式: 2-△△ Ct计算基因的相对表达量,△Ct=Ct(目的基因)-Ct(β-Actin)，△△Ct=△Ct(实验样本)-△Ct (对照样本)。检测引物由天根生化科技(北京)有限公司合成，miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Contro(miR39)由QIAGEN公司合成。

1.3 伦理学审查 本研究经新青海大学附属医院伦理委员会批准，批号：P-SE-2016056，患者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 miRNA表达谱中差异miRNA筛选 2例(1男1女，平均34.5岁)AE患者病灶边缘组织和3例(1男2女，平均41.5岁)AE患者临近病灶边缘正常组织，以及3例(1男2女，平均47.0岁)AE患者血浆样本和3例(1男2女，平均44.7岁)健康体检者的血浆样本共计2549个miRNA中，病灶边缘组与临近病灶边缘正常组比较，以及AE组与健康组比较，存在6个差异miRNA(hsa-miRNA-136-5p、hsa-miRNA-4698、hsa-miRNA-4644、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-1237-3)，其中上调表达有3个miRNA，下调表达有3个miRNA(表1，图1)。

表1 AE患者miRNA表达谱中的差异miRNA

注：a,血浆样本;b,组织样本。灰色点，P>0.05的miRNA;绿色点，log2(差异倍数)绝对值<1.2但P<0.05的miRNA；红色点，log2(差异倍数)绝对值>1.2且P<0.05显著性上调的差异miRNA；蓝色点，log2(差异倍数)绝对值>1.2且P<0.05显著性下调的差异miRNA。

2.3 荧光定量验证与靶基因的预测 验证样本AE组15例患者中男8例，女7例，平均46.1岁；健康组15例患者中男6例，女9例，平均44.6岁。血浆样本验证发现，hsa-miRNA-483-3p和hsa-miRNA-4644上调表达(P值均<0.05)，hsa-miRNA-136-5p下调表达(P<0.05)(表2)，与表1表达模式一致；血浆样本验证发现，hsa-miRNA-483-3p上调表达(P<0.05)(表3)，与表1表达模式一致。验证结果显示,hsa-miNAR-483-3p在血浆中的表达情况与组织中的表达情况一致，表明hsa-miR-483-3p可能是AE前期诊断的一个潜在的标志分子。

表2 血浆中差异miRNA水平影响分析

表3 AE组患者组织中差异miRNA水平影响分析

2.4 靶基因的预测与GO分析 分别用TargetScan、PITA、microRNAorg数据库对差异miRNA进行靶基因预测，对3个数据库预测到的靶基因取交集，共同拥有137个靶基因(图2)。在3个靶基因(PITA、Targetscan、microRNAorg)预测的数据库中，预测到hsa-miRNA-483-3p等调控的靶基因(IL-17A、IL-5、CD40LG、TAP2、TNF、CES1、LBR)，经过查询相关数据库和文献发现，靶基因都是调控参与人体免疫反应及与肝脏疾病有关的基因[22-23]。从图3 GO分析中可以看出，差异表达的miRNA所调控的基因在生物学过程主要涉及依赖DNA的转录调节，其次是参与多细胞生物体的发展调控以及参与T淋巴细胞增值相关的细胞免疫反应等；在分子功能方面主要是与特异性DNA序列结合活性蛋白、泛素结合酶、逆向转运子、甾类激素等蛋白密切相关； 而在细胞成分方面，则与mRNA切割因子复合物、囊泡膜等多种细胞成分有关。可以根据GO分析的结果结合生物学意义从而挑选关于棘球蚴病相关用于后续研究的基因。

图2 差异miRNA在不同的数据库中靶基因预测结果

注：按照P值排序，对前20位的条目(若总条目不大于20，则全部展示)利用条形图进行展示。

2.5 靶基因的KEGG分析 利用KEGG数据库对预测得到的靶基因进行Pathway分析，可以找到富集靶基因的Pathway 条目，在差异miRNA靶基因的 KEGG映射中，对在前20位的条目利用条形图进行展示(图4)。可以发现这些靶基因主要在Primary immunodeficiency信号通路、IL-17信号通路及TNF信号通路中起重要作用。

3 讨论

本实验采用Agilent Human miRNA Microarray芯片，检测病灶边缘带组织与临近病灶的正常肝组织及AE患者和健康体检者血浆中的miRNA，在2549个检测miRNA中，有6个差异性的miRNA，分别为hsa-miR-136-5p、hsa-miR-4698、hsa-miR-4644、hsa-miR-4306、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-1237-3p。文献[24]研究表明miRNA与疾病的发生有关，比如hsa-miRNA-1237-3p表达降低与脊索瘤患者生存不良相关。hsa-miRNA-33b-3p在关节炎患者血清中可调节代谢过程，可作为评估关节炎风险及进展的潜在生物标志物[25]。有研究[26]表明，当肝癌细胞在低糖环境中生长时，miRNA-483-3p低表达，使细胞凋亡，而当细胞在高糖环境中生长时，miRNA-483-3p水平升高，降低了凋亡率。这表明，根据葡萄糖的浓度，miRNA-145-5p对miRNA-483-3p有双重作用，抑制或刺激。这提示可能存在一种在野生型TP53肝癌细胞中抵抗细胞凋亡的新机制，并提示miRNA-145-5p和miRNA-483-3p可能在肝细胞癌中作为药物靶点[27]。而hsa-miRNA-4306是HPV阴性早期头颈鳞状细胞癌患者疾病复发和生存的重要标记[28]。前期研究可以看出本次芯片实验筛选出来6个差异miRNA与人的多种类型的疾病存在密切的相关性，本研究通过青海区域内人感染AE后的差异miRNA情况，hsa-miRNA-33b-3p、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-4306在AE的病灶边缘带这种显著差异性表达的现象，预示着这些miRNA可能在AE中起到非常重要的作用。

注：按照P值排序，对前20位的条目(若总条目不大于20，则全部展示)利用条形图进行展示。

循环miRNA是一类在血清、血浆等体液中稳定存在的分子，循环miRNA涉及到细胞与细胞之间的信息传递，主要作用是靶向调控靶基因[29-30]；无细胞循环miRNA通常存在于核糖核蛋白复合物或高密度脂蛋白中，或从脂质体、微泡、外泌体或凋亡体中释放出来，因此，循环的miRNA可以反映机体的稳态反应以及疾病进展的迹象。由于其稳定性和对内源性RNase活性的抗性，循环miRNA被认为是诊断和判断治疗效果的生物标志物，在癌症、糖尿病和神经紊乱等领域具有临床应用的前景[31-33]。目前关于AE相关的循环miRNA的研究还比较少，本研究旨在找到一个与AE相关的miRNA作为诊断标志物，因此在进行了AE组织miRNA的荧光定量验证后，对于差异的hsa-miRNA-483-3p进行了血浆中的表达检测，结果显示,hsa-miRNA-483-3p在血浆与组织中显著性上调表达，这表明hsa-miRNA-483-3p可能是AE前期诊断的一个潜在的标志分子。

据报道[34-37]，hsa-miRNA-483-3p 在伤口愈合和癌症进程中受到调节，其也是2型糖尿病患者内皮完整性的重要调节因子，是2型糖尿病患者修复内皮再生的潜在治疗靶点[38]。同时也在糖尿病相关的心脏病中起到负调控的作用[39]。综上研究表明，hsa-miRNA-483-3p是一个病程响应分子，在调控疾病进程中扮演着一定的角色。

有研究[40]发现多房棘球绦虫感染小鼠之后，高通量测序分析发现差异miRNA的靶基因同一些与宿主的免疫反应有关。同样地，本研究用TargetScan、PITA、microRNAorg数据库对差异miRNA进行靶基因预测，3个靶基因预测数据库中差异miRNA共同拥有137个,hsa-miRNA-1237-3p、hsa-miRNA-483-3p、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-33b-3p在不同的miRNA靶基因预测数据库中分别预测到不同数量的靶基因，本实验发现AE差异性表达的3个miRNA(miR-1237-3p、hsa-miRNA-4306、hsa-miRNA-483-3p)的靶基因均与人体免疫反应以及AE有关，例如hsa-miRNA-4306预测与AE相关的靶基因为CD40LG(IMG)、TAP2。CD40LG是肿瘤坏死因子配体家族中的一员，主要表达于已激活的T淋巴细胞上，它与B淋巴细胞上CD40相互作用，促进B淋巴细胞增生和存活、免疫球蛋白类型转换及生发中心反应。CD40/CD40LG在诱导B淋巴细胞增生分化、产生自身抗体中起关键作用。肺泡棘球蚴病患者IgG、IgA和IgM的平均水平及囊性棘球蚴病患者IgG和IgM的平均水平均明显高于正常对照组,而TAP2基因的多态性在囊性棘球蚴病具有一定的关系[41]。hsa-miRNA-1237-3p的靶基因 IL-17A、IL-5，囊性棘球蚴病感染后通过增强IL-10和下调IL-5、IL-17A，显著减轻卵白蛋白诱导的气道炎症的严重程度[42]。hsa-miRNA-483-3p的靶基因为lamin B受体，lamin B受体是一种核膜的多跨膜蛋白，常被用作核膜动力学的“报告者”，有研究[43]表明其表达与原发性胆汁性肝硬化有关。

差异miRNA的靶基因GO分析中可以看出，差异基因在生物学过程涉及到细胞免疫反应(T淋巴细胞的增值)等生物学功能，这可能与多房棘球绦虫感染后激发患者体内的免疫系统有关；在差异miRNA靶基因的 KEGG分析可以看到，这些靶基因在Primary immunodeficiency信号通路、IL-17信号通路及TNF信号通路中起重要作用，这些与AE相关的信号通路的发现，将会对后期AE的预防治疗具有提示的意义。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献:任宾、任利负责确诊病例的收集，RNA的提取和文章的撰写；樊海宁、王海久负责统计学分析和文章的修改。