EMS诱变水稻创制抗咪唑啉酮除草剂种质

陈天子 余月 凌溪铁 张保龙

(江苏省农业科学院/江苏省农业生物学重点实验室，江苏南京 210014)

稻田杂草严重影响水稻产量和品质。据统计，稻田杂草致使我国稻谷每年的损失率达15%左右[1]。化学除草是目前广泛普及的稻田除草方式，包括除草剂对土壤封闭处理和对茎叶处理[2]。化学除草有严格的施用范围，使用不当会引发药害，造成水稻减产甚至绝产[3]。因此，培育抗除草剂的水稻品种是克服稻田杂草的经济有效途径。转基因技术是培育抗除草剂作物的有效途径之一，但目前我国尚未批准转基因水稻的商业化种植，不能在生产上推广应用。因此培育非转基因的抗除草剂水稻在生产上意义重大。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)是支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成的第一个关键酶，是磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类 ( imidazolinones，IMI )、三唑嘧啶类(triazolopyrimidines，TP)、 嘧啶氧(硫) 苯甲酸类[pyrimidinylthio (oroxy)-benzoates，PTB；pyrimidinylcarboxyherbicides，PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(sulfonylamino-carbonyltriazolinones，SCT)等ALS 抑制剂类除草剂的作用靶标，ALS 某些氨基酸位点的突变可赋予突变体对ALS 抑制剂类除草剂的耐受性[4]。如水稻ALS 的第95、第96、第171、第548、第627 和第628 位氨基酸突变为某种氨基酸时，可对IMI、SU、PC等除草剂产生抗性[5-9]。美国路易斯安纳州立大学农业中心通过甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)诱变水稻种子并结合常规育种手段，先后培育了CL121、CL131、CL141、CL161 等系列抗咪唑啉酮除草剂的非转基因水稻，并联合巴斯夫公司于2002年以Clearfield 品牌进行商品化种植，成功解决了美国南部水稻种植区最难治的杂草红稻(red rice)的危害，备受当地稻农的欢迎；该水稻仅2005年种植面积就超过24 万hm2，占美国水稻种植面积的17%[10]。其中，CL121 和CL141 抗咪唑啉酮水稻是利用其亲本材料93AS3510 的ALS 第628 位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸带来的抗性，CL161 抗咪唑啉酮水稻则是利用其亲本材料PWC16 的ALS 第627 位氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺而产生的抗性[6，8]。

2018年，巴斯夫公司联合路易斯安那州立大学农业中心将抗除草剂Provisia 水稻推广上市[11]，该水稻属于抗乙酰辅酶A 羧化酶抑制剂的非转基因水稻。生产实践中，β -三酮类除草剂双环磺草酮(benzobicyclon，BBC)用于防除水稻田一年生和多年生杂草已有多年，其作用靶标为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)；但BBC 对不同水稻品种的安全性有较大差异[12]。最近，日本科学家从抗BBC 的粳稻克隆了β-三酮类除草剂抗性基因HIS1 (HPPD inhibitor sensitive1)，该基因编码一种Fe(Ⅱ)/2-氧戊二酸依赖性加氧酶，这种加氧酶通过催化β-三酮类除草剂发生羟基化反应而使之失去毒性，从而赋予植物对多种β-三酮类除草剂的抗性；HIS1 基因缺失28 bp 碱基发生无意突变后，水稻对BBC 敏感，HIS1 基因的表达是造成水稻品种对BBC抗、感差异的原因[13]。目前，我国尚没有抗除草剂水稻品种获得许可登记，但通过筛选人工诱变群体和自然突变群体，也获得了一些非转基因抗除草剂水稻材料。王俊梅等[14]对84 份经过辐照和EMS 诱变后的再杂交水稻材料进行耐草甘膦的筛选，获得5 份耐草甘膦水稻遗传资源。金粳818 是天津市水稻研究所利用津稻9618 和津稻1007 杂交经多年系谱法选育而成的常规品种，在水稻资源进行除草剂筛选过程中发现其具咪唑啉酮除草剂抗性[15]，并具有与CL161 抗咪唑啉酮水稻同样的突变位点，即其ALS的基因编码区第1 880 nt 由G 突变为A，导致第627 位的丝氨酸突变为天冬酰胺[16-17]，推测其抗性可能是在有残留除草剂的大豆田中自然突变所产生[15-16]。广东创新科研团队最近也通过化学诱变筛选方法研发出非转基因抗除草剂水稻材料“洁田稻”[18]。尽管如此，国内研究者创制非转基因抗除草剂水稻的努力尚未能满足市场的巨大需求。近年来，我国水稻轻简化栽培发展较快，免耕和直播稻田杂草的危害日益突出[19-20]。水稻抗除草剂性状已愈来愈受到水稻育种家和种业公司的重视。

因此，本研究通过EMS 诱变水稻种子，然后用咪唑啉酮类除草剂筛选诱变处理的后代种子，获得了与前人报道的ALS突变类型相同的抗除草剂材料，也获得了ALS突变的非转基因抗咪唑啉酮类除草剂的水稻新材料，并对获得的抗除草剂材料开展抗性水平鉴定，旨在为水稻抗除草剂育种提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水稻试验材料为籼稻93-11(由江苏省农业种质资源保护与利用平台提供)。EMS 为美国Sigmaaldrich 公司产品(货号M0880)；硫代硫酸钠产自国药集团化学试剂有限公司；百垄通为水剂型咪唑啉酮类除草剂，由巴斯夫公司生产(有效成分为240 mg·mL-1甲咪唑烟酸)，苗后定向喷雾防治一年生禾本科杂草的推荐用药量为每亩20 ～30 mL，如按每亩兑水45 L计，甲咪唑烟酸的推荐使用浓度范围为107 ～160 mg·L-1。

1.2 水稻EMS 诱变处理和抗除草剂突变体筛选

取水稻种子20 kg，自来水浸泡2 h 后，用0.5%(w/v) EMS 室温下浸泡14 h，加入终浓度为25 g·L-1的硫代硫酸钠中和反应15 min，弃去EMS 溶液，自来水翻动浸泡种子5 次，每次5 min。然后将处理后的种子播种田间，M1植株成熟后，种子混收。取M2种子播种于温室，播后10 d 后对M2幼苗喷施0.67 mL·L-1百垄通，即相当于160 mg·L-1甲咪唑烟酸，20 d 后选择正常绿色且明显长高的抗性株移栽至花盆，收取M3种子。

1.3 抗除草剂突变体ALS 基因克隆与序列分析

根据NCBI 水稻ALS基因保守序列设计扩增ALS基因全长的特异引物OsALS-F 5′-TCGCCCAAACCCAG AAACCC-3′和OsALS-R 5′-CTCTTTATGGGTCATTCAG GTC-3′。以M3抗除草剂单株基因组DNA 为模板，采用TaKaRa PrimerSTAR Max DNA Polymerase 聚合酶扩增ALS基因。PCR 反应体系包括:2×PrimerSTAR Max Premix 10.0 μL、10 μmol·L-1引物各1.0 μL、30 ng·μL-1水稻基因组DNA 1.0 μL，补加无菌水至总体积20 μL。PCR 扩增程序:98℃预变性3 min；98℃变性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸2 min，35 个循环；72℃延伸10 min。取5 μL PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期2 051 bp 片段后，剩余PCR产物经PCR 清洁试剂盒(美国Axygen 公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T 载体(日本TaKaRa 公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12 个大肠杆菌单克隆进行PCR 检测，取PCR 结果呈阳性的3 个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序。测序结果采用BioEdit 和SnapGene 软件分析野生型和突变体ALS基因的DNA 序列差异，确定抗除草剂突变体的ALS突变位点。

1.4 抗除草剂突变体的抗性水平和遗传稳定性鉴定

取3 个抗性株系(编号M133、M135 和M142)M3种子和野生型(WT)水稻93-11 种子，播种纸杯中，每杯12～15 粒种子。在3～4 叶幼苗期时，以不同浓度甲咪唑烟酸(0、12、24、48、72、96、120、240、600、1 200、2 400、 4 800、 7 200、9 600、12 000 mg·L-1)水溶液进行茎叶喷雾处理，每个浓度重复3 次；喷药后21 d 测量株高，并以对照(0 mg·L-1甲咪唑烟酸处理)为基准计算株高抑制率。株高抑制率=(对照组株高-处理组株高)/对照组株高×100%，然后按单向分组组内观察值数目不等资料对每个浓度下的株高抑制率进行方差分析。

1.5 ALS 活性测定

取M142 抗性株系M3和野生型93-11 水稻叶片2～5 g，液氮研磨成粉末，按1 ∶1(w/v)加入提取液[100 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 值7.5)，1 mmol·L-1丙酮酸钠、5 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1焦磷酸硫胺素、1 mmol·L-1二硫代苏糖醇]，待解冻后继续研磨匀浆。用移液器将溶解物转移置冰预冷离心管，12 000 r·min-1、 4℃离心30 min，吸取上清液至新的冰预冷离心管中，获得粗酶液，并置于冰上，立即用于酶活测定。ALS 活性的测定参照陈以峰等[21]的方法。在2 mL 离心管中依次加入700 ～800 μL 反应缓冲液[50 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 值7.0)，200 mmol·L-1丙酮酸钠、1 mmol·L-1MgCl2、1 mmol·L-1焦磷酸硫胺素]、1～100 μL 不同浓度的甲咪唑烟酸水溶液、100 μL 粗酶液；样品管总体积为900 μL，混匀。对照管先加50 μL 3 mol·L-1H2SO4，再加入粗酶液。37℃水浴1 h，样品管加50 μL 3 mol·L-1H2SO4，混匀，60℃孵育15 min，依次加入500 μL 0.83 g·L-1肌酸、500 μL 8.3 g·L-11-萘酚，混匀后60℃水浴15 min，37℃水浴15 min。短暂离心后取上清在ScanDrop 250 分光光度计(德国Analytik Jena 公司)上读取400～640 nm 范围的吸光值，取其最大值计算甲咪唑烟酸各浓度下的ALS相对酶活力及ALS 酶活抑制率。ALS 相对酶活力=甲咪唑烟酸加入组的ALS 吸光值/无甲咪唑烟酸加入组的ALS 吸光值×100%，ALS 酶活抑制率=(无甲咪唑烟酸加入组的ALS 吸光值-甲咪唑烟酸加入组的ALS 吸光值)/无甲咪唑烟酸加入组的ALS 吸光值×100%。按农业行业标准NY/T 1155.8-2007[22]和赵斌等[23]方法，以SPSS 统计软件计算甲咪唑烟酸抑制水稻ALS酶活力至50%时的IC50值。

2 结果与分析

2.1 抗除草剂突变体筛选

甲咪唑烟酸药效慢，喷施百垄通4 d 后，水稻M2幼苗仍无药害症状；喷施10 d 后，绝大部分M2幼苗叶片变浅绿色，有极少数幼苗叶片仍呈深绿色，且植株明显增高；喷施15 d 后，非抗性苗叶片明显失绿、停止生长甚至枯死，抗性苗正常生长，叶片深绿色，株高增长明显(图1)。筛选M2种子约50 kg，共计获得61 个抗性M2单株，成熟后单株收种。

图1 甲咪唑烟酸(160 mg·L-1)茎叶喷雾15 d 后的M2 抗性株Fig.1 The imidazolinone resistant plantlets in M2 population at 15 d of spray with 160 mg·L-1 imazapic

2.2 ALS 基因序列分析

已知植物对咪唑啉酮类除草剂的抗性是源于ALS基因的突变[4]。本研究利用引物组合OsALS-F/OsALS-R 扩增了野生型和抗百垄通除草剂61 个M2株系的M3单株ALS基因序列，每株系各测试3 ～4 个M3单株，获得的特异片段为2 051 bp，包括1 935 bp的ALS开放阅读框。与野生型ALS的开放阅读框序列相比，突变体ALS基因突变类型可分为三类(表1):1)20 个测序株系在第1 880 nt 由G 碱基突变为A 碱基(G1880A)，导致编码的第627 位氨基酸由丝氨酸(AGT)突变为天冬酰胺(AAT)，为已报道的突变类型；2)23 个测序株系在第1 879、第1 880 nt 由AG 碱基突变为CT 碱基(A1879C、G1880T)，导致编码的第627 位氨基酸由丝氨酸(AGT)突变为亮氨酸(CTT)，为新发现的突变类型；3)1 个测序株系检测出同时存在上述两种突变，即A1879C、G1880T 和G1880A，表明该单株ALS基因还未纯合。剩余17 个测序株系中，12个测序株系含有G1880A 突变外，还各检测到1 个或2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP) 或 插 入 缺 失(insertion-deletion，InDel) 突 变(C731A、 C531T、 G1763A、 C429T、 G896A、 C414T、G254A、A1409G、C651A、G1888A、C927T、G216A、1 296～1 297 nt 间插入T 碱基)；5 个测序株系含有A1879C、G1880T 突变外，还各检测到1 个SNP 突变或InDel 突变(T1547C、G198A、C1474T、G1888A、1 330 nt处缺失G 碱基)。由此可推断突变体抗除草剂功能的获得是由于ALS 第627 位氨基酸由丝氨酸(AGT)突变为亮氨酸(CTT)或天冬酰胺(AAT)所致。

表1 61 个抗咪唑啉酮水稻株系在M3 的ALS 基因型分类Table 1 The genotyping of ALS genes in the M3 generation of sixty-one imidazolidone-resistant rice lines

2.3 抗性水平和遗传稳定性鉴定

取3 个抗性株系 M133 (碱基突变类型为G1880A)、M135(碱基突变类型为A1879C、G1880T)和M142(碱基突变类型为A1879C、G1880T/G1880A)后代进行抗性鉴定。茎叶喷雾15 d 后，野生型水稻幼苗经12 mg·L-1甲咪唑烟酸喷雾处理后产生明显的生长抑制、叶片枯蔫等药害症状，且药害症状随除草剂浓度的升高而加重，而抗性株在1 200 mg·L-1甲咪唑烟酸喷雾后才产生轻微叶片枯蔫症状(图2-A)。抗性株经12～96 mg·L-1甲咪唑烟酸喷雾21 d 后，反而促进生长，当喷雾浓度达120 mg·L-1时才出现生长抑制现象(图2-B)。野生型水稻幼苗茎叶经14 个甲咪唑烟酸浓度喷雾30 d 后，所有幼苗全部死亡；抗性株M133在1 200 mg·L-1甲咪唑烟酸喷雾后死亡；抗性株M135和M142 在1 200 mg·L-1甲咪唑烟酸喷雾后生长被抑制，浓度达2 400 mg·L-1时植株死亡(图2-C)。这表明抗性水稻对甲咪唑烟酸的抗性能稳定遗传且其抗性水平不低于1 200 mg·L-1甲咪唑烟酸，其对甲咪唑烟酸的抗性是野生型的100 倍以上。此外，农艺性状测定结果表明，抗性株系M135、M142 的每穗粒数比野生型多出11.5%～13.4%，在株高、穗长、千粒重、抽穗期、结实率等农艺性状上与野生型无明显差异(表2)，具有较好的应用价值。

2.4 ALS 酶活测定

图2 M3 抗咪唑啉酮除草剂水稻的抗性水平Fig.2 The resistance level of M3 imidazolinone-resistant rice

表2 抗咪唑啉酮除草剂水稻的农艺性状Table 2 The agronomic traits of the imidazolidone-resistant rice

ALS 是ALS 抑制剂除草剂的作用靶标，其活性水平是鉴定植物对ALS 抑制剂抗性的重要生化指标。在M142 抗性株叶片粗酶液与10 μmol·L-1甲咪唑烟酸孵育后，产生淡红色产物，而野生型水稻叶片粗酶液产生黄色产物(图3-A)，表明M142 在10 μmol·L-1甲咪唑烟酸下仍具有较高的ALS 酶活性。反应产物在400～640 nm 下扫描测定吸收值，结果显示水稻ALS的红色复合物最大吸收峰在530 nm (图3-B)。取水稻粗酶液与甲咪唑烟酸各浓度孵育后的530 nm 吸收值计算ALS 相对酶活力，结果显示(图3-C)，野生型水稻的ALS 对甲咪唑烟酸极为敏感，ALS 酶活在0.01 μmol·L-1开始受到抑制，并随甲咪唑烟酸浓度的增加酶活性迅速降低，在甲咪唑烟酸浓度为10 μmol·L-1时ALS 相对酶活力为15.15%；而M142 抗性株的ALS 对甲咪唑烟酸的耐受性明显强于野生型水稻，在甲咪唑烟酸浓度为10 μmol·L-1时开始受到抑制，在浓度为10 000 μmol·L-1时ALS 相对酶活力为14.42%。以SPSS 软件对水稻ALS 酶活抑制率的几率值和甲咪唑烟酸浓度的对数值进行直线回归分析，求得野生型水稻IC50=2.037 μmol·L-1，M142 抗性株IC50=222.099 μmol·L-1，即M142 抗性株对甲咪唑烟酸的耐受性是野生型水稻的109 倍。

3 讨论

图3 水稻ALS 酶活性测定Fig.3 The enzyme assay of rice ALS

目前绝大部分抗ALS 抑制剂作物的抗性机制是源于ALS基因碱基突变造成氨基酸残基位点变异，引起ALS 抑制剂(除草剂)与ALS 蛋白结合性降低，从而使得突变表对该除草剂体现为不敏感或耐受性[4，24]，也有个别报道由细胞色素P450 单加氧酶基因CYP72A31、CYP81A6 等编码代谢酶降解除草剂所致[25-28]。本研究在对抗除草剂突变体进行抗性筛选和抗性表型进行鉴定的基础上，对部分抗除草剂突变体进行了基因型鉴定，确认这些突变体是在水稻ALS蛋白第627 位丝氨酸(AGT) 被突变为天冬酰胺(AAT)或亮氨酸(CTT)。水稻ALS 第627 位丝氨酸对应于拟南芥ALS 第653 位丝氨酸。该位点氨基酸发生突变后获得抗ALS 抑制剂除草剂的功能在许多作物和杂草中都已被报道，包括水稻[6，8]、油菜[6，24]、玉米[6]、小麦[6]等，其除草剂抗性功能都是源于单碱基突变造成ALS 第653 位丝氨酸(以拟南芥ALS 氨基酸序列位置为标准)突变为天冬酰胺、苏氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸[4]。如前所述，CL161 和金粳818 抗性水稻在该位点的氨基酸突变类型是丝氨酸突变为天冬酰胺[6，10，17]。本研究还发现水稻ALS 第627 位丝氨酸的2 个碱基AG 同时突变为CT 后，造成丝氨酸变为亮氨酸，突变体也具有抗咪唑啉酮类除草剂功能，该位点产生亮氨酸突变类型此前鲜见报道。ALS 抗性突变位点的不同、替换氨基酸残基种类的不同，导致其蛋白结构不同，其抗除草剂特点也不同[29]，如含627 天冬酰胺突变的CL161 对咪唑啉酮除草剂的抗性是CL121(含628 谷胺酸突变)的5 倍[30]。随着对更多EMS 诱变水稻材料进行抗ALS 抑制剂类除草剂筛选和基因型分析，还可能发现ALS 基因产生其他新的氨基酸突变类型能赋予抗除草剂功能。

抗草甘膦转基因农作物的大面积推广表明转基因是培育抗除草剂作物的有效途径之一。但转基因作物自面世以来，其环境安全和食品安全等问题一直备受公共部门、学术界和普通公众的广泛关注，引发的争议也在一定程度上阻碍了转基因作物的发展。如我国转植酸酶基因玉米和转Bt 基因抗虫水稻在2009年已获得生产应用安全证书，但至今尚未进行商业化生产，其原因之一是基于国内有关转基因的舆论氛围，以及我国对转基因主粮作物产业化进程稳重、谨慎的考虑[31]。所以，我国目前仍未批准抗除草剂转基因水稻的商业化。相比之下，传统育种手段培育的作物品种由于没有导入外源物种基因，更容易被接受和推广，如抗咪唑啉酮油菜及油菜籽可以自由进入欧盟及其他国家[32]，抗咪唑啉酮除草剂的非转基因Clearfield 水稻在美国也产生了良好的经济效益[10]。EMS 属于常用的一种化学诱变剂，可产生丰富的基因组突变及表型突变类型，广泛用于植物诱变育种[33-34]。本研究通过EMS 诱变水稻93-11 种子筛选到的抗咪唑啉酮除草剂水稻能耐受不低于1 200 mg·L-1甲咪唑烟酸，而野生型水稻在甲咪唑烟酸浓度为12 mg·L-1时就已死亡，表明所获得抗性水稻对甲咪唑烟酸的抗性水平是野生型的100 倍以上。ALS 酶活测定结果也揭示抗性水稻对甲咪唑烟酸的耐受性是野生型的109 倍。该抗除草剂性状对咪唑啉酮抗性倍数高，且能稳定遗传，具备生产应用价值。利用同样的手段，在华占、1892S 不育系、嘉花1 号、淮稻5 号、临稻16 号、镇稻18 号、镇糯19 号、圣稻19 号、苏秀867 等多个水稻品种上都成功获得抗咪唑啉酮除草剂的突变材料。它们对咪唑啉酮除草剂的抗性源于水稻基因组碱基突变产生，无转基因环境释放的安全性问题，在控制免耕和直播稻田杂草方面具有广阔的推广应用前景。此外，本研究发现低浓度百垄通茎叶喷雾处理对抗性水稻的生长有促进作用的现象。该现象是由除草剂产品本身还是由抗性突变体自身基因型引发产生还有待进一步验证和确认。

4 结论

本研究通过EMS 诱变获得的抗咪唑啉酮水稻突变体材料可耐受不低于1 200 mg·L-1甲咪唑烟酸，其抗性水平是野生型的100 倍以上，抗性倍数高，且能稳定遗传，具有生产应用价值。其抗除草剂功能源于ALS基因开放阅读框在第1 879、第1 880 nt 由AG 碱基突变为CT 碱基，或在第1 880 nt 由G 碱基突变为A碱基，导致编码的第627 位氨基酸由丝氨酸(AGT)突变为亮氨酸(CTT)或天冬酰胺(AAT)；其中第627 位氨基酸由丝氨酸(AGT)突变为亮氨酸(CTT)鲜有报道。突变后的水稻ALS 对咪唑啉酮类除草剂的耐受性显著提高，其IC50是野生型水稻的100 倍以上。在当前我国严格监管转基因水稻的背景下，该非转基因的抗除草剂水稻具有广阔的应用前景。