酸枣仁蛋白酶解产物功能特性及抗疲劳活性研究

韩荣欣，张红印，沈颖昕，范琳，邵帅，衣春光，严铭铭

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

酸枣仁为鼠李科植物酸枣[Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）HuexH.F.Chou]的干燥成熟种子，具有养心补肝、宁心安神、敛汗生津的功效[1]，是镇静安神的良药。现代药理学研究表明酸枣仁具有镇静、抗惊厥、抗炎以及抗肿瘤等作用[2]。作为卫生部所认证的药食同源食品，酸枣仁中富含皂苷、黄酮、生物碱、脂肪酸以及蛋白质等成分，其中皂苷类、黄酮类成分被认为是发挥镇静催眠作用的主要成分，已得到了广泛研究[3-4]。据文献报道，酸枣仁中蛋白质成分高达40%，包含18种人体所需的氨基酸，可作为保健食品中的蛋白质来源，具有较好的研究前景[5-6]。

近年来食源性植物蛋白因其具有抗氧化、降血压、抗菌以及增强免疫功能等生物活性得到广泛关注，但由于蛋白质的分子量较大，空间结构复杂，人体摄入后不容易被消化吸收，难以有效发挥其营养价值。采用酶解法对蛋白质进行改性处理，可使蛋白质转化为具有适宜分子大小、电荷分布的肽类，反应条件温和、专一性强、不影响蛋白质的营养价值。相关研究表明，蛋白质的酶解产物具有比蛋白质更好的功能特性（如乳化性、起泡性和溶解性等[7-9）]，同时也有研究发现蛋白酶解物具有良好的生物活性（如抗氧化活性[10]、免疫活性[11]、降血压活性[12]、抗疲劳活性[13]等），酶解法已成为蛋白质改性研究的热点方向。

疲劳已经成为亚健康的主要表现而得到人们的重视，目前已有研究从动植物中提取出多种具有抗疲劳作用的多肽，抗疲劳肽不仅可提供人体所需氨基酸，还具有增强机体抗氧化能力等优点，已成为抗疲劳研究领域的热点[14]。目前国内外对于酸枣仁蛋白的研究多集中于蛋白提取工艺和氨基酸组成分析，尚未有对酸枣仁蛋白酶解产物功能特性的报道，本研究将对酸枣仁蛋白酶解处理，研究酶解产物的功能特性和抗疲劳活性，为扩展酸枣仁药材研究领域以及酸枣仁蛋白酶解产物在保健食品行业中的应用发展提供参考依据。

1 试剂与仪器

1.1 药材与试剂

酸枣仁药材：安徽亳州药材市场；碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；血清尿素氮、血乳酸、肝糖原、肌糖原、乳酸脱氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、Na+-K+-三磷酸腺苷酶检测试剂盒：南京建成生物工程研究所有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

HX-400A型高速中药粉碎机：浙江省永康市溪岸五金药具厂；HH-6数显恒温水浴锅：金坛市佳美仪器有限公司；DF-101S集热式磁力搅拌器：金坛市医疗器械厂；DZF-6050型真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；UV-1700紫外分光光度计：日本岛津（中国）有限公司；AB135-S电子分析天平：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；HZP-L502数字型pH计：福州华志科学仪器有限公司；5804R低温离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；SCIENTZ-50F冷冻干燥机：宁波新芝冻干设备股份有限公司；K9840自动凯氏定氮仪：济南海能仪器股份有限公司。

1.3 实验动物

6周龄～8周龄的雄性ICR小鼠，体重18 g～22 g，购于辽宁长生生物技术有限公司。

2 方法

2.1 酸枣仁药材脱脂处理

取酸枣仁药材，粉碎后过4号筛，置于石油醚[料液比 1 ∶5（g/mL）]中浸泡脱脂 24 h[15]，室温 25 ℃下3 000 r/min离心10 min，沉淀在通风橱中干燥，过4号筛，得到脱脂的酸枣仁粉末。

2.2 酸枣仁蛋白的提取

取脱脂酸枣仁粉末，按1∶25（g/mL）的料液比加入蒸馏水溶解，用1 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH 11，57℃恒温搅拌提取50 min，3 000 r/min离心20 min，过滤得上清液，用1 mol/L的盐酸溶液调节溶液pH 4，置于4℃下静置2 h，3 000 r/min离心10 min，沉淀用水复溶，用1 mol/L的NaOH调节溶液pH 7，透析48 h，冻干得酸枣仁蛋白[16]。

2.3 酸枣仁蛋白的酶解

取酸枣仁蛋白，加入蒸馏水溶解配制成5%的蛋白溶液，酶占底物的质量分数为2%，分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，分别调节至最适温度和最适pH值酶解3 h，酶解完毕后，将溶液置于90℃水浴中灭酶10 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液，冻干得酸枣仁蛋白酶解产物[9]。

2.4 最适蛋白酶的筛选

2.4.1 不同蛋白酶解产物水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定

总氮含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法进行测定。氨基酸态氮含量：采用GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中的酸度计法进行测定[17]。

DH/%=（氨基酸态氮含量/总氮含量）×100

2.4.2 不同蛋白酶解产物蛋白质回收率的测定

采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定酸枣仁脱脂粉的蛋白质含量，采用福林酚法测定酸枣仁蛋白酶解产物中蛋白质含量，按下式计算蛋白质回收率。

蛋白质回收率/%=（酶解产物中蛋白质的质量/酸枣仁脱脂粉中蛋白质的质量）×100

2.4.3 不同蛋白酶解产物对小鼠负重游泳时间的影响

取不同蛋白酶的酶解产物，按200 mg/kg的剂量给小鼠灌胃，比较3种蛋白酶产物对小鼠负重游泳时间的影响。

2.5 功能特性测定

2.5.1 溶解性

取酸枣仁蛋白酶解产物加蒸馏水制备成1%的溶液，分别调节溶液pH值（2～12）后，5 000 r/min离心15 min，取上清液，用福林酚法分别测定上清液和样品溶液中的蛋白质含量[18]。

溶解性计算公式：溶解性/%=（上清液中蛋白质含量/样品中蛋白质含量）×100

2.5.2 持水性

取0.5 g酸枣仁蛋白酶解产物，置于10 mL刻度离心管中，加入10 mL蒸馏水，搅拌混合1 min，使样品均匀分散在水中，不同温度（20、40、60、80、100 ℃）水浴加热30 min，4 000 r/min离心20 min，去除上清液，称量刻度离心管质量[19]。

持水性计算公式：持水性/（g/g）=（m2-m1）/m0

式中：m0为样品质量，g；m1为样品质量+离心管质量，g；m2为去除上清液后的样品质量+离心管质量，g。

2.5.3 吸油性

取0.5 g酸枣仁蛋白酶解产物，置于10 mL离心管中，加入大豆色拉油3 mL，将样品与色拉油混匀，不同温度下（20、40、60、80、100 ℃）静置 1 h，4 000 r/min 离心20 min，吸取上层未被吸附的色拉油，称量质量[19]。

吸油性计算公式：吸油性/（g/g）=（m2-m1）/m0

式中：m0为样品质量，g；m1为样品质量+离心管质量，g；m2为吸油后的样品质量+离心管质量，g。

2.5.4 起泡性及起泡稳定性

配制1%的酸枣仁蛋白酶解产物样品溶液50 mL，调节不同梯度的pH值（2～12），记录体积V0，置于高速分散器中10 000 r/min搅打1 min，记录总体积V1，静置30 min后再次记录其总体积V2，按下式计算起泡性和起泡稳定性[20]。

起泡性/%=（V1-V0/V0）×100

起泡稳定性/%=[（V2-V0）/（V1-V0）]×100

2.5.5 乳化性（emulsifying activity index，EAI）及乳化稳定性（emulsion stability index，ESI）

配制0.1%的酸枣仁蛋白酶解产物样品溶液9 mL，调节不同梯度的pH值（2～12），加入3 mL大豆色拉油，10 000 r/min高速均质2 min，形成均一的乳化液，取50 μL于试管中，再加入5 mL 0.1%的十二烷基硫酸钠溶液，于500nm处测定吸光值A1，乳化液静置30min后再次测定吸光度值A2，按下式计算乳化性和乳化稳定性[20]。

EAI/（m2/g）=（2×2.303×A1×D）/（Φ×c×L×10 000）

ESI/min=[（A1×Δt）/（A1-A2）]×100

式中：D为稀释倍数；Φ为油相的体积分数，%；L为光程，1 cm；c为酸枣仁蛋白酶解产物质量浓度，g/mL；t为时间，min。

2.6 抗疲劳活性的测定

2.6.1 小鼠分组与给药

小鼠在正常条件下自由摄食饮水，适应7 d后随机分为5组（n=10）：空白对照组（等剂量蒸馏水）、酸枣仁蛋白组（SZP，200 mg/kg）、酸枣仁蛋白酶解产物低剂量组（SZPHs-LG，100 mg/kg）、酸枣仁蛋白酶解产物中剂量组（SZPHs-MG，200 mg/kg）以及酸枣仁蛋白酶解产物高剂量组（SZPHs-HG，400 mg/kg），连续给药30 d。

2.6.2 小鼠负重游泳实验

小鼠末次给药30 min后，在其尾部固定其重量为其体重5%的铅皮，置于水深30 cm的游泳箱中（50 cm×50 cm×40 cm）进行游泳实验，水温控制在（25±1）℃，记录小鼠开始游泳至头部没入水面下10 s不能上浮所用的时间，游泳后将小鼠取出用吹风机吹干，休息5 d用于后续研究[21]。

2.6.3 抗疲劳生化指标的测定

末次给药30 min后让小鼠在无负重状态下游泳90 min，休息1 h后摘眼球取全血，4℃放置3 h，凝固后3 000 r/min离心15 min制备血清；分离肝脏及骨骼肌组织，用生理盐水制备成10%的组织匀浆，-80℃保存备用。测定全血中乳酸（blood lactic acid，BLA）含量、血清中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力、血清尿素氮（serum urea nitrogen，SUN）含量；测定肝脏和骨骼肌中肝糖原、肌糖原、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、Na+-K+-三磷酸腺苷酶（Na+-K+-adenosine triphosphate protease，Na+-K+-ATPase）的含量，以上生化指标含量测定方法严格按照试剂盒说明操作[21]。

2.7 数据分析

采用SPSS 20.0软件进行单因素（ANOVA）方差分析并进行两两比较，试验结果均采用平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 最佳蛋白酶的筛选

不同蛋白酶对酸枣仁蛋白酶解产物水解度和蛋白回收率的影响见图1，对小鼠负重游泳时间的影响见表1。

图1 不同蛋白酶对SZPHs水解度和蛋白回收率的影响Fig.1 Effect of different proteases on DH and rate of protein recovery of SZPHs

表1 不同SZPHs对小鼠负重游泳时间的影响Table 1 Effect of different SZPHs on forced swimming time in mice

如图1和表1所示，3种蛋白酶均具有延长小鼠游泳时间的作用，同时具有较好的水解度和蛋白回收率，本研究从水解度、回收率、抗疲劳活性3个方面综合考虑，选用碱性蛋白酶为最适蛋白酶。

3.2 酸枣仁蛋白酶解产物功能特性研究

3.2.1 溶解性

酸枣仁蛋白及其酶解产物溶解性如图2所示。

由图2可知，酶解产物溶解性明显优于酸枣仁蛋白，并在较宽的pH值范围（2～12）内具有良好的溶解性，这是由于蛋白质酶解处理后，水解成为分子量更小的肽段或者氨基酸，分子结构变小，比表面积增加，溶解性增强。酸枣仁蛋白及其酶解产物的溶解性在不同pH值条件下呈先下降后升高趋势，并在pH 4时，酸枣仁蛋白及其酶解产物溶解性达到最小值，这是由于此时溶液pH值达到了酸枣仁蛋白的等电点，蛋白质的正负电荷数相等，分子间发生聚合，导致溶解性变小；当pH值小于或大于4时，蛋白质则以较多的正离子或负离子状态存在，相同离子间相互排斥，静电斥力增加，溶解性逐渐变大[22]。

图2 不同pH值对SZP及SZPHs溶解性的影响Fig.2 Effect of different pH value on solubility of SZP and SZPHs

3.2.2 持水性、吸油性

持水性和吸油性试验结果如图3所示。

图3 不同温度对SZP及SZPHs持水性、吸油性的影响Fig.3 Effects at different temperature on water absorption and oil absorption capacity of SZP and SZPHs

由图3可知，酸枣仁蛋白及其酶解产物的持水性受温度影响不大，酸枣仁蛋白酶解产物的持水性远远小于酸枣仁蛋白，这是由于酸枣仁蛋白经酶解后，酶解产物的分子量变小，分子的界面面积变小，对水的吸附能力变小，进而导致其持水性变小。

酸枣仁蛋白及其酶解产物具有较好的吸油性。酸枣仁蛋白在较宽温度范围内吸油性变化不大，而酸枣仁蛋白酶解产物的吸油性随着温度的升高而降低，这是由于温度升高时，油的黏度变小，其对酸枣仁蛋白酶解产物的吸附能力随之减小，导致其吸油性变小[23]。

3.2.3 起泡性及起泡稳定性

起泡性和起泡稳定性试验结果如图4所示。

图4 不同pH值对SZP及SZPHs起泡性及起泡稳定性的影响Fig.4 Effects at different pH value on foaming capacity and stability of SZP and SZPHs

如图4所示，与酸枣仁蛋白相比，酸枣仁蛋白酶解产物具有良好的起泡性，这是因为酶解后溶解性显著提升，溶于水后增强了蛋白的伸展性，提高了其起泡能力，同时酶解产物的黏度降低，有利于降低表面张力进而促进泡沫形成。此外，酸枣仁蛋白及其酶解产物在pH 2～12范围内，起泡性变化规律为先减小后增大，并在pH 4时起泡性达到最低，此时为酸枣仁蛋白的等电点，溶解性较差，导致空气-水界面的蛋白含量较低，起泡性较差，随着pH值逐渐增大，溶解性逐渐增强，空气-水界面分布的蛋白质逐渐增多，起泡性也随着增强。

酸枣仁蛋白及其酶解产物起泡稳定性随着pH值的增加呈现先增大后减小的趋势。且酸枣仁蛋白酶解产物的起泡稳定性略低于酸枣仁蛋白，这是由于酸枣仁蛋白经酶解后所得酶解产物黏度降低，虽使得其起泡性增强，但同时也使得酶解产物与水形成的液膜强度降低，导致其起泡的稳定性低于酸枣仁蛋白。

3.2.4 乳化性及乳化稳定性

乳化性和乳化稳定性试验结果如图5所示。

由图5可知，酸枣仁蛋白酶解产物的乳化性强于酸枣仁蛋白，这是由于蛋白质酶解后，蛋白分子中的疏水基团不断暴露出来，有利于蛋白质吸附油水界面，促进其乳化性增强。乳化性变化规律与溶解性相似，且pH 4时乳化性达到最小，此时为酸枣仁蛋白的等电点，溶解性最小，油水界面上吸附的蛋白变少，形成乳状液面的面积变小，导致此时乳化性降低，随着pH值变大，蛋白质溶解性变大，分散在油水界面的蛋白质增多，有利于乳化性逐渐增强。

酸枣仁蛋白及其酶解产物乳化稳定性随着pH值的增加呈先减小后增大再减小的趋势。此外，酸枣仁蛋白酶解产物的乳化稳定性略强于酸枣仁蛋白，这是由于其溶解性大大提高，溶液体系中小分子蛋白含量增加，油水界面分布的蛋白增多，流动性增强，阻止了蛋白质的聚集，使得乳化稳定性有所提高。

图5 不同pH值对SZP及SZPHs EAI和ESI的影响Fig.5 Effects at different pH value on EAI and ESI of SZP and SZPHs

3.3 抗疲劳活性研究

酸枣仁蛋白酶解产物对小鼠负重游泳时间、BLA、LDH、SUN的影响结果见表2。

表2 SZPHs对小鼠负重游泳时间、BLA、LDH、SUN的影响Table 2 Effects of SZPHs on forced swimming time，BLA and LDH activity，and SUN in mice

3.3.1 酸枣仁蛋白酶解产物对小鼠负重游泳时间的影响

如表2所示，连续给药30 d后，与对照组相比，酸枣仁蛋白酶解产物各剂量组和酸枣仁蛋白组均可显著延长小鼠负重游泳时间（P＜0.05），且酸枣仁蛋白酶解产物低剂量组延长效果与酸枣仁蛋白组相当，中、高剂量组延长效果强于酸枣仁蛋白组（P＜0.05），表明酸枣仁蛋白酶解产物可延长小鼠负重游泳时间，增强小鼠耐力，发挥抗疲劳的活性。

3.3.2 酸枣仁蛋白酶解产物对血清生化指标的影响

如表2所示，与对照组相比，酸枣仁蛋白酶解产物各剂量组和酸枣仁蛋白组可显著降低BLA和SUN的含量（P＜0.05或 P＜0.01），提高 LDH 的活性（P＜0.05或P＜0.01）；此外酸枣仁蛋白酶解产物中BLA和SUN的减少率以及LDH活性均高于酸枣仁蛋白组（P＜0.05），表明酸枣仁蛋白酶解产物可催化乳酸转化为丙酮酸，减缓乳酸积累，加速乳酸清除，同时降低血清中尿素氮的含量，起到抗疲劳的作用。

3.3.3 酸枣仁蛋白酶解产物组织生化指标的影响

酸枣仁蛋白酶解产物组织生化指标的影响结果见表3。

表3 SZPHs对肝肌糖原、SOD、GPX、MDA、Na+-K+-ATPase的影响Table 3 Effects of SZPHs on glycogen，SOD，GPX，MDA and Na+-K+-ATPase

与对照组相比，酸枣仁蛋白酶解产物各剂量组和酸枣仁蛋白组可显著提升小鼠肝糖原、肌糖原储备，提高体内Na+-K+-ATPase、SOD、GPX的活性，降低体内 MDA 的含量（P＜0.05或 P＜0.01）；与酸枣仁蛋白组相比，酸枣仁蛋白酶解产物中、高剂量组可显著提升肝糖原、肌糖原含量（P＜0.05）；酸枣仁蛋白酶解产物各剂量组对SOD、GPX、Na+-K+-ATPase的活性影响和MDA的减少率也强于酸枣仁蛋白组（P＜0.05），表明酸枣仁蛋白酶解产物可提高小鼠体内糖原储备、抑制体内氧化应激、提高能量代谢酶的活性，发挥抗疲劳的作用。

4 讨论与结论

本研究对酸枣仁蛋白进行酶解处理，对酶解产物的功能特性进行了研究，并与酸枣仁蛋白进行了比较。结果表明，酸枣仁蛋白经酶解后，虽持水性和起泡稳定性有所降低，但其溶解性、吸油性、起泡性、乳化性及乳化稳定性均具有较大的提高，并在较宽的pH值和温度范围内保持良好的特性；特别是溶解性试验中，酸枣仁蛋白酶解产物在水中具有快速全部溶解的特性，此特性优于其它植物蛋白酶解产物（如花生蛋白酶解物[24]、大豆蛋白酶解物[22]、核桃蛋白酶解物[7]等），当其被人体摄入后可有效溶解，提高其体内的吸收利用率，这表明酸枣仁蛋白酶解产物可作为一种添加剂有效应用到食品加工领域中。

本研究通过给小鼠灌胃酸枣仁蛋白及其酶解产物，测定酸枣仁蛋白酶解产物对小鼠负重游泳时间和相关抗疲劳的生化指标，研究其抗疲劳活性。实验结果表明，酸枣仁蛋白酶解产物可有效延长小鼠负重游泳时间，提高体内LDH、SOD、GPX和Na+-K+-ATPase的活性以及肝糖原和肌糖原水平，并有效延缓BLA、SUN以及MDA的积累，提示酸枣仁蛋白酶解产物具有一定的抗疲劳活性。通过与酸枣仁蛋白相比较，发现酸枣仁蛋白酶解产物的抗疲劳活性略有提升，表明肽类物质的分子量小于蛋白的分子量，可更加有效地被人体吸收，提升其生物活性。此外，相关文献报道[25]，不同分子量的酶解产物的抗疲劳活性也不相同，这其中分子量小于1 000 kDa的寡肽抗疲劳活性较为明显，提示着生物活性与分子量大小有关，因此酸枣仁蛋白酶解产物的分离纯化以及不同组分的活性也有待进一步研究。

综上所述，酸枣仁蛋白酶解产物具有比酸枣仁蛋白更好的功能特性和抗疲劳活性，表明酸枣仁蛋白酶解产物可添加到食品中作为一种有效的氨基酸来源，发挥其营养价值和保健功效，为日后酸枣仁在保健食品领域的应用发展提供理论依据。