茶多酚-羧甲基壳聚糖水凝胶促进大鼠创面修复研究

陈 凯，柳云恩，佟昌慈，丛培芳，马瑞珩

1.上饶师范学院生命科学学院 上饶农业技术创新研究院，江西 上饶 334000；2.北部战区总医院 急诊医学部，辽宁 沈阳 110016

皮肤撕裂伤是老年人和婴儿常见的急性创伤[1]。急性创伤可发展为慢性复杂创伤，增加患者的经济和心理负担，降低生活质量。生长因子是治疗皮肤创伤的主要药物，但会增加瘢痕组织形成和癌症风险[2]。因此，需要开发其他促进皮肤创面修复和再生的有效药物或生物活性材料。羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)是由壳聚糖经甲基化制得，含有阳离子(-NH3+)和阴离子(-COO-)基团。CMCS水凝胶具有抗菌活性，可防止伤口感染，促进细胞增殖，加速胶原沉积，并刺激伤口愈合过程[3-4]。有研究表明，CMCS水凝胶是一种良好的生物相容性材料，可作为创面修复的候选敷料[5]。茶多酚(epigallocatechin gallate，EGCG)具有显著的抗炎、抗衰老、抗菌、抗癌、抗肥胖、调节肠道菌群等功效[6]，还可以降低创面的炎症反应，加速创伤修复，促进创面表皮再生，是一种具有良好生物安全性的、能够加速创面修复的天然原材料[7]。本研究旨在制备一款新型的EGCG-CMCS水凝胶，并探讨其对大鼠创面的保护和修复作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 EGCG购自麦克林公司，CMCS由中国科学院金属研究所提供(平均分子量为6.2×104,脱乙酰度为84%)。实验用水为实验室制备的双次蒸馏去离子水，其余药品均购自国药。45只SPF级健康雄性SD大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号SCXK(辽)2015-0001，体质量180～220 g，单笼饲养，自由饮水和饮食，适应环境7 d。大鼠饲养条件：室温条件下，湿度50%～60%，灯光-黑暗12 h昼夜循环。

1.2 CMCS和EGCG-CMCS水凝胶制备 CMCS水凝胶：15.0 ml离心管中称取0.2 g壳聚糖，置于无菌操作台，经紫外照射1.0 h灭菌后，加入10.0 ml灭菌去离子水，充分溶解后，形成0.2% CMCS水凝胶，4.0℃避光保存。EGCG-CMCS水凝胶：15.0 ml离心管中称取0.2 g壳聚糖+0.3 g茶多酚，置于无菌操作台，经紫外照射1.0 h灭菌后，加入10.0 ml灭菌去离子水，充分溶解后，形成EGCG(0.3%)-CMCS(0.2%)水凝胶，4.0℃避光保存。

1.3 大鼠皮肤全缺损模型建立 大鼠腹腔注射10.0%水合氯醛(4.0 ml/kg)进行麻醉，用剃须刀剃掉大鼠背部约1 600.0 mm2的毛，用脱毛膏脱掉短毛，用75.0%酒精消毒，用灭菌后的打孔器在大鼠脊背中心划出直径为1.5 cm的圆形印，用灭菌后手术剪刀剪去圆形中结缔组织层上的全层皮肤，完成皮肤全层缺损模型。

1.4 分组与给药 45只大鼠被随机分入空白组、CMCS水凝胶组、EGCG-CMCS水凝胶组，每组各15只。建模成功后，每天给予CMCS水凝胶组和EGCG-CMCS水凝胶组大鼠创面CMCS水凝胶和EGCG-CMCS水凝胶，连续3 d。给药前，用生理盐水冲洗创面及创面周围，然后拍照，给药后单笼饲养。大鼠皮肤组织分别在术后7、10、15 d取材。

1.5 创伤面积测量 每天对伤口区域(新表皮未覆盖的区域)进行拍照，由两位经验丰富的研究人员独立用Imagej1.48软件进行分析。创伤恢复百分比用下列公式计算：

创伤恢复百分比=(第1天创伤面积-第n天创伤面积)/第1天创伤面积×100%

1.6 组织学观察 术后7、10、15 d采集皮肤标本。皮肤组织用10%甲醛固定2～3 d，经梯度酒精脱水、包埋、切片、苏木精-伊红染色及改良Masson染色。在显微镜下观察组织创面生长情况和胶原沉积。

2 结果

2.1 3组大鼠体质量变化情况 3组大鼠术后当天饮食均有一定减少，随后恢复正常。术后1 d，3组大鼠体质量均下降，EGCG-CMCS水凝胶组大鼠体质量降低最少；术后2 d，3组大鼠体质量均显著增加；术后3～15 d，3组大鼠体质量均逐渐增加。同一时间点，EGCG-CMCS水凝胶组大鼠体质量略高于其他两组。实验过程中，3组大鼠创面及创面附近未发生肿胀、出血、起泡、局部并发症、感染等；另外，大鼠的物理运动参数，如探索行为、行动、后腿站立等也未出现明显的疼痛迹象。见图1。

图1 3组大鼠体质量变化情况

2.2 3组大鼠创面愈合情况 术后3 d，3组大鼠创面均呈干燥状态，创面及周围皮肤组织未见明显的红肿、分泌物及感染状态；同时，创面周围毛发开始生长。术后7 d，3组大鼠创面明显缩小，EGCG-CMCS水凝胶组创伤恢复百分比高于其他两组(P<0.05)。与空白组创面结痂呈坚硬状态不同，EGCG-CMCS水凝胶组创面结痂完全脱落，出现新生肉芽组织；术后15 d，3组创伤恢复百分比接近，但空白组结痂仍未完全脱落，CMCS水凝胶组和EGCG-CMCS水凝胶组的结痂均已完全脱落，创面恢复情况显著好于空白组(P<0.05)。见图2。

图2 3组大鼠创面愈合情况

2.3 3组大鼠创面组织病理学变化情况 苏木精-伊红染色显示：术后7 d，空白组大鼠组织中含有少量的新生肉芽组织、新生毛细血管及胶原蛋白沉积，同时伴有大量的炎症细胞、水肿、坏死细胞及血块，而CMCS水凝胶组和EGCG-CMCS水凝胶组均呈现出对于炎症细胞的明显抑制效果；CMCS水凝胶组创面观察到大量的新生肉芽组织，伴随大量的新生毛细血管、少量炎症细胞及大量的胶原蛋白沉积，EGCG-CMCS水凝胶组创面处具有最多的新生肉芽组织和新生毛细血管，表面细胞大量增殖，已经出现较为致密的胶原纤维，炎症细胞基本消失；术后15 d，CMCS水凝胶组和EGCG-CMCS水凝胶组创面处出现大量的新生血管、肉芽组织及致密的胶原纤维；EGCG-CMCS水凝胶组的上表皮化水平和胶原蛋白纤维致密水平显著好于其他两组(P<0.05)。见图3。Masson染色显示：各时间点的EGCG-CMCS水凝胶组的胶原纤维含量均为最高的，空白组的胶原纤维含量均为最低(P<0.05)。见图4。

图3 3组大鼠组织病理情况

图4 3组大鼠创面胶原纤维情况

3 讨论

伤口愈合是一个涉及纤维细胞、巨噬细胞、表皮细胞等多种细胞类型的动态过程[8]。创伤修复过程中的一个关键指标就是创面处新血管形成。创面处新血管形成和增殖可以为创面带来营养物质，促进细胞增殖和胶原蛋白沉积[9]。本研究发现,EGCG-CMCS水凝胶组大鼠体质量略高于其他两组，且局部创面未发现肿胀、出血、感染等症状；EGCG-CMCS水凝胶组创伤恢复百分比高于其他两组(P<0.05)，且EGCG-CMCS水凝胶组创面结痂完全脱落，出现新生肉芽组织；EGCG-CMCS水凝胶组可见大量新生肉芽组织和新生毛细血管，表面细胞大量增殖，已经出现较为致密的胶原纤维，炎症细胞基本消失；EGCG-CMCS水凝胶组的上表皮化水平和胶原蛋白纤维致密水平显著好于其余两组，胶原纤维含量也显著高于其余两组(P<0.05)。这提示，EGCG-CMCS水凝胶增强创伤修复速度可能是EGCG和CMCS协同作用的结果。CMCS水凝胶被广泛认为是理想的伤口敷料，因其具有良好的生物安全性和多种生物活性[10]。有研究报道，CMCS水凝胶具有隔绝外界细菌的作用，可为创面愈合提供持续的湿润环境，含有促进上皮细胞迁移、生长等作用及运载多种小分子的活性物质，是一种很好的药物载体[11]。Huang等[12]提出，EGCG可通过靶向 Notch促进链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠创面愈合。EGCG可放大具有适当的抗张强度、孔隙度、吸收伤口渗出物的膨胀性伤口贴片的效力，通过调节生长因子和炎症细胞因子，发挥收缩创面、促进胶原沉积、加强创面血管化的作用，加速愈合[7]。

综上所述，EGCG-CMCS水凝胶具有良好的促进血管生成和表皮再生作用，可促进大鼠创面的胶原蛋白沉积和肉芽组织形成，加速创面愈合。