凝血酶激活纤溶抑制物基因CPB2单核苷酸多态性与不明原因复发性流产的关联探讨

2021-01-31 12:36广东省深圳市大鹏妇幼保健院518120胡春青刘玉美唐晓勇雷永革
首都食品与医药 2021年2期
关键词:纤溶附表等位基因

广东省深圳市大鹏妇幼保健院(518120)胡春青 刘玉美 唐晓勇 雷永革

URSA是临床妇产科较为常见的疾病,即指发生连续两次及以上,无法找到明确原因的复发性流产[1]。近年来,随着人们生活方式的改变,临床中URSA发生率呈现逐渐升高趋势,不仅对女性顺利生育造成影响,且对社会、夫妻生活造成一系列问题。有文献显示,早期URSA发生中,TAFI水平表达异常;TAFI高水平表达,对降低URSA风险具有一定作用。鉴于此,本研究将100例URSA患者作为研究对象,对TAFI基因CPB2单核苷酸多态性进行分析,报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2019年7月~2020年6月我院和深圳市光明区人民医院妇产科收治的100例URSA患者作观察对象,将其设为观察组;所有患者均符合相关诊断标注,患者年龄18~40岁,平均(28.1±7.2)岁。筛选同期正常健康孕龄期女性200例,年龄19~39岁,设为对照组,平均年龄(27.5±6.8)岁,其中非孕100例、在孕100例。两组妇女基本资料均衡可比(P>0.05)。

1.2 方法 所有研究对象均于清晨空腹抽取外周静脉血5ml,其中3ml于一次无抗凝剂的干燥管内于室温静置30min后,离心(3500r/min)5min,用作检测血清中PAI-1水平。另外2ml静脉血于乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管内,混匀,用于PAI-1基因单核苷酸多态性分析。所有样本均于-20℃保存备用,统一进行批检。

仪器与试剂:AE275全自动酶标分析仪试剂购于上海太阳生物技术有限公司;DNA 提取试剂盒购于美国AXYGEN公司;ABI7500型实时定量突光聚合酶链式反应仪由美国ABI公司提供;基因SNP多态性分析试剂盒购自上海吉凯公司。

附表1 两组CPB2 SNPs基因型与等位基因频率分布

附表2 两组CPB2 SNPs连锁不平衡分析

附表3 两组PAI-1基因4G/5G多态性分布

PAI-1水平检测:采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中PAI-1水平,操作均严格按试剂和仪器说明书进行,检测前对仪器进行保养、校正,检测时同时设计空白孔、阴阳孔及质控孔,待上述所有检测孔的OD值均在参考有效范围内才进行标本结果判读,否则重新进行检测。

PAI-1基因单核苷酸多态性分析[2]:(1)基因DNA提取:使用DNA提取试剂盒抽提标本中DNA;(2)PCR法目的片段扩增;(3)引物设计:参照文献设计PCR引物序列(广州金域检测中心提供),PAI-1基因启动子区引物序列:①4G上游引物:5′-GTCTGGACACGTGGGGA-3′;②5G上游引物:5′-GTCTGGACACGTGGGGG-3′;③阳性对照上游引物:5′-AGCTTTTACCATGGTAACCCC T G G T-3′;④共同下游引物:5′-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3′。4G和5G分别在2个反应体系中进行:一管加入引物①、③、④;另一管加入引物②、③、④。经PCR反应和琼脂糖凝胶电泳。

结果判断[3]:4G和5G的PCR产物长度均为135bp,阳性对照段PCR产物长为256bp,若只出现4G则为4G/4G基因型;只出现5G则为5G/5G基因型;4G和5G同时出现为4G/5G基因型。部分PAI-1基因单核苷酸多态性分析将送往广州华银检验中心进行检测、确认分析。

1.3 统计学 将数据纳入SPSS21.0统计软件中进行分析,计数资料比较采用x2比较,以率(%)表示;计量资料比较采用t检验,以(±s)表示,若P<0.05则表示差异显著,有统计学意义。

2 结果

2.1 两组CPB2 SNPs基因型与等位基因频率分布 研究显示,rs1926447、Rs2277440、Rs9316179、Rs7337140、Rs3742264、Rs2296642等6个已知SNP点位在两组中分布符合Hardy-Weinberg平衡,且呈现多态性(P>0.05)。观察组Rs9316179等位基因C、Rs7337140等位基因G、Rs3742264等位基因A、Rs2296642等位基因C频率分布均低于对照组(P<0.05);经Bonferroni多重检验校正分析显示,两组妇女Rs9316179、Rs7337140基因型、等位基因频率分布对比,有统计学意义(P<0.05),详见附表1。

2.2 分析GPB2 SNPs连锁不平衡 研究显示,观察组妇女Rs3742264-rs9316179点位组合中GGTT频率显然高于对照组妇女,有统计学意义(P<0.05),且经FDR、Bonfermni多重检验校正结果显示P<0.05,详见附表2。

2.3 两组PAI-1基因4G/5G多态性分布 研究显示,观察组URSA患者等位基因4G、基因型频率4G/4G显然高于对照组(P<0.05);与5G/5G基因型比较,URSA的发生与4G纯合子妇女、携带4G等位基因妇女相关,OR为4.822、2.810。而同时兼有PAI-1基因4G/4G基因型患者,发生URSA风险更高(P<0.01)(CI:2.294~7.366),详见附表3。

3 讨论

URSA是临床妇产科常见疾病,其病因复杂,目前尚不完全清楚,大部分学者认为与男性精液异常、内分泌失调、感染性疾病、解剖学结构畸形、遗传异常等存在相关性。一般而言,健康女性妊娠期机体中纤维蛋白溶解酶、抗凝物质水平下降,促凝血因子水平呈现升高,机体血液呈现高凝状态,极大增加妊娠期高危并发症风险;且孕妇长期处于这种状态,可造成外周凝血功能异常,胎盘微血管血栓风险增高,对胎儿血供、胎盘血供造成影响,增加流产发生率[4]。

目前,已有研究认为,在局部凝血-纤溶系统中TAFI对精确调控起到重要作用。TAFI介导的蛋白C介导凝血抑制与纤溶抑制,在血栓调节蛋白作用下,可对机体凝血功能进行精确调控,同时对血栓引起的下游炎症反应起到共同抑制效果,同时,TAFI不影响血栓外正常凝血功能,仅对局部纤溶抑制进行调控。目前,已有较多研究证实,CPB2基因多态性点位与突变点位与TAFI相关[5]。

本研究经Bonferroni多重检验校正分析显示,两组妇女Rs9316179、Rs7337140基因型、等位基因频率分布对比P<0.05,与URSA发生呈现负相关。观察组妇女Rs3742264-rs9316179点位组合中GGTT频率显然高于对照组妇女(P<0.05),且经FDR、Bonfermni多重检验校正结果显示P<0.05,因此,本研究认为,rs9316179不具有临床效应,在两组rs9316179分布差异中由强连锁导致。

PAI-1具有防止血栓形成的功能,被认为是纤溶酶原激活物主要抑制因子。当该基因点位突变是纤溶酶原激活物(PA)与PAI动态平衡被打破,PA与PAI-1结合,形成一种无活性、稳定的复合物,增加血栓形成风险[6]。有研究认为,PAI-1基因转录与PAI-1基因启动区域4G等位基因相关,有助于促进该基因表达[7]。患者体内PAI-1水平中,5G/5G型体内PAI-1浓度最低、4G5G杂合子基因携带者次之、4G4G纯合子基因携带者浓度最高[8]。

本研究显示,URSA患者等位基因4G、基因型频率4G/4G显然高于对照组(P<0.05);与5G/5G基因型比较,URSA的发生与4G纯合子妇女、携带4G等位基因妇女相关,OR为4.822、2.810。而同时兼有PAI-1基因4G/4G基因型患者,发生URSA风险更高(P<0.01)(CI:2.294~7.366)。

综合以上,URSA妇女中普遍存在CPB2基因遗传易感,PAgT(ADP)水平在rs3742264基因型间存在差异,rs3742264等位基因A是URSA保护等位基因,对妇女妊娠具有积极作用;PAI-1基因4G/5G多态性与URSA发生存在密切相关性。

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