LC-MS/MS法同时测定中药注射剂中3种成分的含量

孙 卫，汪赛赛，贾倩倩，付 佳，李 智，韩省力*(.西安交通大学药学院，西安 7006；.天津天士力之骄药业有限公司，天津 30040)

中药注射剂具有生物利用度高及作用迅速等特点，在治疗心脑血管疾病、感染性疾病及肿瘤辅助治疗等方面效果显著，临床应用范围广泛[1]。但中药注射剂临床应用不良反应较多，以类变态反应为主[2-3]。明确中药注射剂中引发类变态反应的物质基础并控制其含量，对保证中药注射剂的临床应用安全至关重要。

注射用益气复脉与生脉注射液均源于中国著名传统古方“生脉散”，以红参为君药，大补元气，鼓舞清阳；麦冬为臣药，养阴生津，清心除烦；五味子为佐使，敛肺宁心，止汗生津[4]。主治冠心病劳累型心绞痛，慢性左心功能不全心力衰竭、心律失常、冠心病及病毒性心肌炎等疾病[5-8]。2种中药注射剂均由3味中药提取制成，成分复杂，含糖量高，不良反应发生率高[9]。国家药品不良反应监测中心病例报告数据库显示，在生脉注射液的安全问题中，严重变态反应表现最为突出。5-羟甲基糠醛(5-HMF)广泛存在于含糖注射液中[10-11]，化学性质活泼，具有广泛的药理活性[12-16]，前期研究表明，5-HMF具有较强的致敏作用。因此测定注射用益气复脉和生脉注射液中5-HMF的含量对于2种中药注射剂的质量控制及安全性评价具有重要意义。

高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法具有灵敏度高、操作简便和分离效果好等优点，广泛用于复杂体系中微痕量成分的准确定量[17-19]。本研究建立了灵敏、快速的LC-MS/MS法，用于测定多批次注射用益气复脉和生脉注射液中5-HMF、人参皂苷Rd与人参皂苷Rg3的含量。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-MS/MS 8040型高效液相-三重四级杆质谱联用仪，SHIMADZU VP-ODS色谱柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)，AUY120型分析天平(日本岛津公司)；0.22 μm微孔滤膜(德国Merck公司)；Milli-Q型纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2试药 5-HMF(批号18110903，质量分数为98.23%)，人参皂苷Rd(批号19061306，质量分数为98.97%)，人参皂苷Rg3对照品(批号18120607，质量分数为99.17%)，均购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈为色谱纯，购自德国默克公司；注射用益气复脉(冻干)(批号：20170501，20170505，20170604，20170702，20170812)，购自天津天士力之骄药业有限公司；生脉注射液(批号：17090122，14040111，14030211，13120811，13031011)，购自国药集团宜宾制药有限责任公司。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用SHIMADZU VP-ODS色谱柱(150 mm×2.0 mm，5 μm)。流动相：1 mL·L-1甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，梯度程序：0～6 min，5%B；6～20 min，5%B～80%B；20～25 min，80%B。柱温：35 ℃；流速：0.2 mL·min-1；进样体积：5 μL；离子源：ESI源；脱溶剂管线温度：250 ℃；加热块温度：400 ℃；雾化气流速：3 L·min-1；干燥气流速：15 L·min-1；正离子模式检测电压：+4.5 kV；负离子模式检测电压：-3.5 kV。利用对照品溶液建立MRM方法，定量离子对：5-HMF (126.9→109.2)；人参皂苷Rd (945.60→945.50)；人参皂苷Rg3(783.5→113.1)。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 精密称取3种成分对照品适量，分别置于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度分别为1.102，1.232，1.021 g·L-1的单一对照品储备液。精密吸取上述单一对照品储备液，用甲醇稀释成不同质量浓度的混合对照品溶液，4 ℃保存，备用。

2.2.2供试品溶液 精密称取注射用益气复脉(冻干)0.65 g，加入2 mL超纯水，摇匀，溶解，过0.22 μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液稀释100倍作为供试品溶液1；取生脉注射液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，稀释100倍作为供试品溶液2。

2.3方法学验证

2.3.1专属性实验 取2.2项下制备的混合对照品溶液和2种供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，得到总离子流图(TIC)，见图1，考察本方法的专属性。由图1可知，3种成分色谱峰附近无其他峰干扰，专属性满足含量测定要求。

图1 总离子流图

2.3.2线性实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积。以混合对照品溶液质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归，得3种成分的回归方程分别为：y1=43.91x1-1 722.4(r1=0.997 2)，y2=255.87x2+44 307(r2=0.998 3)，y3=289.5x3+8 114(r3=0.999 8)，进样质量浓度分别在53.76～2 204.00，61.60～2 464.00，51.05～2 042.00 ng·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.3检测限与定量限 将最低质量浓度的混合对照品溶液逐级稀释，按照2.1项下色谱条件进样分析，目测法计算0～25 min内信噪比(S/N)，当S/N=3时，3种成分的检测限分别为2.20，2.05，1.02 ng·mL-1，当S/N=10时，3种成分的定量限分别为5.51，10.27，5.11 ng·mL-1。

2.3.4精密度实验 取2.2.1项下制备的混合对照品溶液，同日进样3次，得日内精密度，计算3种成分峰面积的RSD值分别为0.97%，0.73%，1.20%；每日进样1次，连续3 d，得日间精密度，计算得3种成分峰面积的RSD值分别为2.53%，4.30%，1.20%，精密度满足含量测定要求。

2.3.5重复性实验 取2.2.2项下制备的2种供试品溶液，分别连续进样6次，记录色谱峰面积，计算得到注射用益气复脉中3种成分峰面积的RSD值分别为4.74%，2.01%，4.91%；生脉注射液中3种成分峰面积的RSD值分别为1.13%，1.95%，2.18%，表明该方法重复性良好。

2.3.6稳定性实验 取2.2.2项下制备的2种供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样，记录注射用益气复脉中3种成分的色谱峰峰面积，计算得到RSD值分别为3.01%，2.80%，1.60%；记录生脉注射液中3种成分的色谱峰峰面积，计算得到RSD值分别为2.78%，1.53%，3.01%。结果表明，2种供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.7回收率实验 取同一批注射用益气复脉样品(批号20170501)，按照2.2.2项下方法制备9份供试品溶液，平均分为3组，每组分别加入一定量的对照品，加入量分别为测得量的80%，100%，120%，按照2.1项下色谱条件进样测定，计算平均回收率，结果见表1。

表1 回收率结果 (n=3)

2.4含量的测定 取各批次注射用益气复脉(冻干)和生脉注射液，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定，各样品重复测定3次，记录色谱峰峰面积。见表2和表3。

表2 注射用益气复脉的含量测定结果

表3 生脉注射液的含量测定结果

3 讨论

本实验建立了能同时测定3种成分的LC-MS/MS法，该方法专属性强、重复性好、稳定性好、精密度高、回收率满足实验要求，进而对注射用益气复脉与生脉注射液中3种成分进行了含量测定。《中国药典》2015年版规定，5-HMF在葡萄糖注射液中限量为11.80 μg·mL-1，结合其临床使用方法，本实验检测样品中5-HMF的含量远低于《中国药典》2015年版规定的限量[20]，且注射用益气复脉中5-HMF的含量低于生脉注射液的含量，推测原因可能是注射用益气复脉采用了冻干工艺，糖类在该储存条件下性质较稳定，不易转化生成5-HMF。

5-HMF作为糖类降解产物，广泛存在于各种含糖注射剂中。由于5-HMF的不稳定性，在中药注射液的复杂环境下，会进一步生成聚合物，引发不良反应，因此测定中药注射剂中5-HMF的含量对于确保中药注射剂的安全使用、减少不良反应具有重要意义。