指纹图谱结合一测多评法评价拟草果质量的研究

冯 军，柴 玲，陈明生，袁健童，刘布鸣

广西中医药研究院 广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022

拟草果又称白草果、广西草果，为姜科豆蔻属植物拟草果Amomum paratsao-koS.Q.Tong et Y.M.Xia 的干燥成熟果实，主产于广西、云南等省区，在广西主产地为那坡县壮族集居地，靖西、隆林等地也有分布[1-2]。在广西民间常作草果A.tsao-koCrevost et Lemarie的代用品用作提香或者药用，为常用壮药，收载于《广西壮族自治区壮药质量标准第三卷》，用于寒湿内阻、脘腹胀痛、呕吐泄泻等症[3]，其中含量测定项仅以总挥发油含量控制药材质量，尚无具体化学成分的含量测定标准。目前，对拟草果有少量的研究报道[4-7]，尚未发现关于拟草果质量评价相关的研究报道。

课题组前期研究发现，拟草果中含有多种黄酮类成分[4]，其中鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4’-二甲氧基黄酮化学结构类似。鼠李柠檬素含量较高，其他2 个成分含量较低且市售对照品价格昂贵。本研究拟建立拟草果指纹图谱并采用一测多评（QAMS）法同时测定拟草果中鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮的含量，以期为拟草果药材的质量评价提供方法参考。

1 仪器与试药

Agilent1260 高效液相色谱仪（美国，含四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD 检测器），梅特勒XS-205 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-5200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-S4型数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）。

拟草果分别采自广西那坡县（批号150907、150908、160828、160829）、隆林县（批号170909、170910、181009、181010）、靖西市（批号190912、190913），编号依次为S1～S10。经广西中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为姜科豆蔻属植物拟草果A.paratsao-koS.Q.Tong et Y.M.Xia 的干燥成熟果实；鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4’-二甲氧基黄酮为自制对照品，经光谱结构确定HPLC 峰面积归一化法计算，质量分数均≥98%。乙腈、甲醇（Fisher 公司）为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm），以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱：0～10 min，30%乙腈；10～65 min，30%～90%乙腈；平衡时间15 min；体积流量1 mL/min；柱温25 ℃；进样量10 µL；DAD 双通道检测，检测波长300、366 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别取鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.060、0.204、0.092 mg/mL 的对照品母液，分别精密吸取对照品母液1、2.5、5 mL 至10 mL 量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液。鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮质量浓度分别为 30.0、51.0、9.2 μg/mL。

2.2.2 供试品溶液的制备 取拟草果粉末（过40目筛）约1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，回流提取（64 ℃）1 h，取出，放冷，用甲醇补足质量，摇匀，0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 HPLC 指纹图谱的建立

2.3.1 精密度试验 精密吸取供试品溶液（批号150907）10 µL，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，以鼠李柠檬素为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD 均小于1.5%，6 次进样指纹图谱相似度均大于0.99，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 精密吸取供试品溶液（批号150907）10 µL，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样分析，记录色谱图，以鼠李柠檬素为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD 均小于3%，6 个时间点采集的指纹图谱相似度均大于0.98，表明供试品溶液24 h 内稳定。

2.3.3 重复性试验 取拟草果样品（批号150907）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品，按“2.1”项色谱条件分析，记录色谱图，以鼠李柠檬素为参照峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD 均小于3%，6 份样品的指纹图谱相似度均大于0.99，表明方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价 分别取10 个批次拟草果样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品，在“2.1”项下色谱条件分析，记录色谱图，图谱按《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004年版）分析，自动匹配确立15 个共有峰，与混合对照品保留时间对比，共确认3 个成分，分别是鼠李素（2 号峰）、鼠李柠檬素（6 号峰）、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮（9 号峰），采用平均值法生成对照指纹图谱。结果10 批次样品指纹图谱与对照指纹图谱（R）相似度分别为0.997、0.997、0.997、0.997、0.937、0.968、0.989、0.989、0.992、0.993，均大于0.9。10 批拟草果样品指纹图谱见图1，对照指纹图谱见图2，混合对照品图谱见图3。

2.3.5 共有峰相对保留时间及相对峰面积计算鼠李柠檬素峰保留时间适中，峰形较好且峰面积较大，选择作为参考峰，计算各共有峰相对保留时间及相对峰面积，结果见表1、2。

图1 10 批拟草果样品指纹图谱Fig.1 Fingerprints of ten batches of A.paratsao-ko samples

图2 对照指纹图谱Fig.2 Reference fingerprint

图3 混合对照品HPLC 色谱图Fig.3 Chromatogram of reference substances

2.4 QAMS 法定量分析

2.4.1 色谱条件及样品制备同“2.1”“2.2.1”“2.2.2”项下方法。

2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取系列浓度的混合对照品溶液10 µL 进样，记录色谱图，以进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），得鼠李素回归方程：Y＝3 007.3X＋0.577，r＝0.999 99；鼠李柠檬素回归方程：Y＝3 928.5X－4.7861，r＝0.999 99；3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮回归方程：Y＝4 473.9X－2.65，r＝0.999 99。结果表明：拟草果中鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮进样量分别在0.06～0.60、0.102～1.020、0.018 4～0.184 0 μg，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

表1 10 批样品共有峰相对保留时间Table 1 Relative retention time of common peaks of 10 batches of samples

表2 10 批样品共有峰相对峰面积Table 2 Relative peak area of common peaks of 10 batches of samples

2.4.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10µL 进样6 次，记录色谱图，结果鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮峰面积的RSD值分别为0.14%、0.13%、0.15%，说明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液（批号150907），分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，测定峰面积，结果鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮峰面积的 RSD 值分别为0.41%、0.41%、0.44%，说明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.4.5 重复性试验 取同一批（批号150907）拟草果样品6 份，每份约1 g，精密称定，按“2.2”项供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮含量分别为1.25、2.42、0.40 mg/g，RSD 值分别为0.57%、0.61%、0.67%，说明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取已测定的拟草果（批号150907）粉末（过40 目筛）约0.5 g，精密称定，平行称取9 份，置具塞锥形瓶中，按标准品与供试品含量比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1 分别加入各标准品，每个比例配置3 份，分别精密加入50 mL 甲醇，称定质量，回流提取（64 ℃）1 h，取出，放冷，用甲醇补足质量，摇匀，0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。各供试品溶液进样体积10 μL，测定峰面积，计算回收率，结果鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮平均回收率分别为 100.31%、100.23%、100.63%，RSD 分别为0.97%、1.44%、1.11%，结果表明方法回收率良好。

2.4.7 相对校正因子（f）的测定 分别吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、20 μL，测定各成分的峰面积和保留时间，根据文献研究方法[8-9]，分别计算鼠李素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮与内参物鼠李柠檬素的f及相对保留值，结果f鼠李柠檬素/鼠李素＝1.300、f鼠李柠檬素/3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮＝0.885，RSD 分别为0.20%、0.44%。

2.4.8 样品测定 分别取10 个批号拟草果样品，按“2.2.2”项供试品溶液制备供试品，在“2.1”项色谱条件下测定，采用外标法（EMS）与QAMS法分别对拟草果中的3 种黄酮类成分含量进行测定，结果2 种方法测定的结果基本一致，采取QAMS 法测定拟草果中鼠李素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮的含量结果准确可靠，见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的确定

采用DAD 检测器采集供试品溶液的三维光谱图，结果显示，鼠李素、鼠李柠檬素、3,5-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮紫外吸收特征相似，均在366 nm处有最大吸收，而在300 nm 处其他特征组分具有较好吸收，故选择双波长法同时测定指纹图谱及3种成分的含量。

表3 QAMS 法与EMS 法测定拟草果中3 种成分的含量Table 3 Contents of three compositions of A.paratsao-ko determined by QAMS and EMS

3.2 供试品制备方法的考察

经对比超声和回流2 种提取方法，结果显示，2 种方法提取色谱图基本一致，但回流法提取效率更高，故选择回流提取。进一步考察提取溶剂、溶剂用量以及提取时间等参数，最终确定上述本实验供试品制备方法。

3.3 方法应用

采用本实验建立的方法，对不同批次的拟草果和草果分别进行分析，结果显示，二者特征图谱有明显差异，拟草果中含有的黄酮类成分群均未在草果中检出。广西民间常将拟草果作为草果的代用品，主要是利用其含有的挥发油成分起提香作用，而作为临床药用时则不宜用于替代草果。

4 结论

QAMS 法结合指纹图谱技术，既发挥QAMS法简便、易行、经济的优点，又体现指纹图谱整体、全面的优势。指纹图谱与含量测定采用同一方法，简化了分析过程，降低分析成本。所建立的方法同时达到定性、定量2 个目的，可作为拟草果药材的质量评价方法。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突